不同聚合度菊粉對乳清蛋白基乳液結構和氧化穩定性的影響

陳嘉豪,周文昊,劉剛,張海枝,秦新光

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院,湖北 武漢,430000)

目前人們對功能性食品的追求不斷增大,最受歡迎的產品是那些添加了益生元、富含生物活性化合物的益生菌、維生素和礦物質的產品。在乳制品行業中,許多飲品屬于水包油(oil/water,O/W)型乳劑飲料,并利用益生元化合物達到降脂、降糖等目的[1]。人們日常生活中的蔬菜含有菊粉益生元,是一種水溶性植物儲存多糖,屬于一類非消化碳水化合物果聚糖,對腸胃健康起到有益的作用[2]。一些研究表明,菊粉具有顯著的生物學效應,通常被用作益生元[3]、脂肪替代物[4]、蔗糖替代物[5]添加到各類健康食品中,可能具有穩定和增強乳液乳化特性的作用[6]。

乳液是一種熱力學不穩定系統,通常出現絮凝、油脂酸敗等,影響乳液穩定性以及改變口感[7]。由于菊粉并沒有界面活性,形成乳液后穩定性差,通常使用乳化劑將其制作成乳液用于食品工業生產[8]。乳清分離蛋白(whey isolate protein,WPI)是奶酪加工過程中的副產物,常用于乳制品、烘焙、肉類、零食和糖果產品,擁有較好的乳化性質,但制成乳液后的氧化穩定性并無顯著提升[9-10]。研究顯示:蛋白質-多糖的相互作用可能會改變蛋白質的功能特性,如界面活性、溶解度、發泡或乳化特性,這些相互作用能夠使功能性食品乳液的結構和性質發生改變。從這個意義上說,蛋白質-多糖的相互作用對于開發新產品和加工食品是極為重要的[11]。

隨著生活質量的提高,人們對健康食品越來越重視,從而有著很多脂肪替代物、益生元產品的出現[12]。DE SOUZA PAGLARINI等[13]通過菊粉的凝膠特性,使乳液形成能夠穩定冷藏的脂肪替代凝膠。YANG等[14]研究發現,對菊粉進行疏水改性有利于乳液遞送活性物質,增加其在乳液中的穩定性。LI等[15]通過微波處理使連續相暴露更多的疏水基團,吸附在石榴籽油表面,形成穩定的乳液,明顯地改善了石榴籽油的氧化穩定性。目前國內大都研究植物蛋白和菊粉復配乳液,李楊等[16]利用蛋白質與多糖的相互作用,改善了豌豆分離蛋白乳液的絮凝以及穩定性。關于菊粉-蛋白乳液凝膠以及對植物蛋白乳液穩定性的研究越來越多,但是關于菊粉對WPI乳液的氧化穩定性還未曾報道。為了研究不同聚合度下不同濃度菊粉對WPI穩定的水包油型乳液的形成、穩定性以及氧化穩定性的影響,通過粒徑、激光共聚焦、乳化性質、初級氧化產物值等對其進行穩定能力的表征,本研究將了解乳清分離蛋白-菊粉復合物作為乳劑飲料在食品工業中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白,美國Hilmar Ingredients公司;短鏈菊粉(short chain inulin,SCI)、中鏈菊粉(medium chain inulin,MCI)、橄欖油食品級,上海麥克林生物科技有限公司;尼羅紅、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),阿拉丁試劑(上海)有限公司;去離子水、NaOH、HCl,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

STARTER pH計,奧豪斯儀器有限公司;T-18型高速剪切機,德國IKA工業設備基團;高壓均質機,ATS Engineering AH-2010;Malvern Nano-ZS動態光散射粒度儀、Msatersizer 3000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;F-4600熒光分光光度計,日本日立有限公司;DSA30R界面流變儀,德國呂克士公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合物制備

將WPI溶液、SCI溶液、MCI溶液室溫下在磁性攪拌臺上攪拌2 h,攪拌完成后將WPI溶液依次與短鏈菊粉、中鏈菊粉混合,復合物溶液中WPI最終質量分數為2%,短鏈菊粉最終質量分數為2%、4%、6%、8%(下同),天然菊粉最終質量分數為2%、4%、6%、8%(下同)。用2 mol/L的NaOH溶液將復合物溶液pH值調整為7.0±0.2,為了使蛋白充分水合,將復合物溶液保存到4 ℃冰箱過夜,待用。

1.3.2 乳液制備

復合物與橄欖油按照9∶1(質量比)混合后,在T-18型高速剪切機,12 000 r/min下均質3次,每次2 min,間隔30 s,制成粗乳液后,通過高壓均質機70 MPa均質1次后,形成最終乳液。

1.3.3 復合物Zeta電位測定

使用動態激光散射儀器對連續相不同質量分數菊粉(0%、2%、4%、6%、8%,下同)在室溫(25 ℃)環境下測量連續相的電位,每個樣品12次測量。

1.3.4 復合物內源熒光光譜測定

根據實驗室以往的方法稍作修改,使用F-4600熒光分光光度計,用去離子水(pH 7.0)稀釋適當倍數,樣品裝入石英比色皿中,在280 nm的波長下被激發,然后獲得300～500 nm的發射光譜,激發和發射狹縫寬度設置為5 nm。

1.3.5 乳液粒徑測定

按照實驗室以往的方法,使用Mastersizer 3000型激光粒度儀測定樣品的粒徑分布和平均粒徑,樣品性狀為球形,樣品折射率為1.469,分散劑折射率為1.330,測定第0、7、14、21天的粒徑變化。

1.3.6 絮凝指標

根據實驗室以往的方法,1%(質量分數)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液為分散劑,其他同乳液粒徑的測定相同,測定乳液的絮凝指標U。計算如公式(1)所示:

(1)

式中:d4,3water,1.3.5節所得乳液粒徑;d4,3SDS,樣品池中加入SDS所得乳液粒徑。

1.3.7 界面蛋白吸附含量

按照實驗室以往的方法,吸取新鮮制備的乳液2 mL 放入離心管中,12 000 r/min 離心 20 min,后用注射器小心吸出下層清液并通過0.22 μm的微孔濾膜。下層清液中蛋白質的含量使用Bradford法測量,界面蛋白吸附量(absorption,AP)的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:ρ,樣品的初始質量濃度,mg/mL;ρL,樣品下層清液的質量濃度,mg/mL。

1.3.8 乳化性質分析

根據實驗室以往的方法,測定了不同濃度菊粉(0%、2%、4%、6%、8%)乳液的乳化活性指數(emulsifying activity index,EAI)和乳劑穩定性指數(emulsion stability index,ESI),乳液在高壓均質后靜置0和10 min,取出1 μL的乳液分散在300 μL 1 mg/mL SDS溶液,通過酶標儀測量500 nm處的吸光值,吸光值在0和10 min時分別記為A0和A10。EAI和ESI的計算如公式(3)和公式(4)所示:

(3)

(4)

式中:DF,樣品的稀釋倍數;ρ,未乳化前WPI的質量濃度,mg/mL;φ,乳液中的油水比(0.1)。

1.3.9 激光共聚焦

采用激光共聚焦(confocal laser scanning microscope,CLMS)(Olympus FluoView FV10i)對乳液微觀結構進行觀察。按照實驗室以往的方法稍作修改,制備了尼羅紅(0.1%,質量分數)和FITC(0.1%,質量分數)熒光染色劑,取200 μL乳液與100 μL的FITC以及10 μL尼羅紅混合10 s以上,然后將樣品放在共聚焦顯微鏡的載玻片上,輕輕覆蓋載玻片,其中尼羅紅用于油相染色,FITC用于水相染色。

1.3.10 氧化穩定性分析

實驗室以往的方法稍作修改,分別將橄欖油和乳液放置于50 ℃烘箱中進行加速氧化處理,并且每隔3 d測定橄欖油和乳液中的氧化產物含量。

初級氧化產物的測定:取0.3 mL的乳液與 1.5 mLV(異辛烷)∶V(異丙醇)=3∶1充分混合,然后將充分混合的溶液在 10 000 r/min 離心5 min。取 200 μL 離心混合液的上層油相依次加入2.8 mLV(甲醇)∶V(丁醇)=2∶1、15 μL 亞鐵溶液(0.132 mol/L BaCl2溶液和0.144 mol/L FeSO4充分混合)和15 μL 3.94 mol/L的硫氰酸銨溶液。將混合液于室溫黑暗中反應20 min,利用酶標儀測量在 510 nm 處的吸光度。標準曲線用過氧化氫異丙苯來建立。

次級氧化產物的測定:硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)溶液的配制:依次加入0.15 g/mL三氯乙酸、0.025 mol/L HCl溶液、3.75 mg/mL硫代巴比妥酸溶液。取 1 mL 乳液與2 mL的TBA溶液充分混合,將充分混合的溶液在沸水浴中加熱 15 min,隨后置于冰水中冷卻至室溫,在 4 000 r/min 離心 10 min。利用酶標儀測量532 nm處的吸光度。標準曲線用1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶液來建立。

由圖4可知，當集裝箱運輸需求量小于90 TEU時，集裝箱拖車經濟性更好，集裝箱運輸需求量等于90 TEU時兩者經濟性相當，大于90 TEU時水上“巴士”優勢更明顯.

1.4 數據統計分析

以上實驗均重復3次,數據以平均值±標準差表示結果。對所得數據采用SPSS軟件進行方差分析,取顯著性水平P<0.05,并采用Origin 2021制圖。

2 結果與討論

2.1 WPI與菊粉在水中的相互作用

2.1.1 Zeta電位測量

制備了不同聚合度下不同質量分數菊粉(0%、2%、4%、6%、8%,下同),蛋白質含量(2%質量分數)保持不變,對乳液中作為連續相的體系在pH 7.0的環境下進行電位表征。有研究表明,離子間靜電斥力的存在使得分子間保持著一定距離,Zeta電位的絕對值超過20 mV能夠對乳液提供足夠的穩定[17],所以擁有良好的電動勢對乳液形成的穩定是至關重要的。表1中表示了不同聚合度下不同質量分數菊粉(0%, 2%, 4%, 6%, 8%)測定的Zeta電位值。所有連續相體系在pH 值為7.0時均顯示負電位,低濃度菊粉連續相中電位與對照組連續相并無明顯差異,電位的絕對值超過了20 mV,說明了低濃度菊粉對WPI溶液有良好的穩定作用。

表1 WPI-菊粉溶液的Zeta電位Table 1 Zeta potential of WPI-inulin solution

高質量分數的菊粉連續相(6%、8%)Zeta電位的絕對值低于20 mV,相較于低質量分數菊粉連續相(2%、4%)的電位-22.47 mV以及-22.63 mV的變動很大,由于菊粉是一種非離子多糖[18],導致連續相電位絕對值降低的可能原因是高濃度的菊粉增加了蛋白質-多糖體系的電荷屏蔽效應,這種變化導致高濃度的菊粉黏彈性增大向凝膠化趨勢的轉變[19],有研究指出當菊粉的添加量超過10%時會形成凝膠[20],對乳液的形成以及在食品工業上乳液飲料的應用具有一定影響,且菊粉質量分數在6%、8%時,連續相穩定性最差。

2.1.2 復合物內源熒光光譜分析

乳清蛋白分離物中含有大量的熒光物質,如色氨酸等[21],碳水化合物存在的情況下,會使WPI的熒光基團暴露[22]。如圖1所示,不同聚合度下不同質量分數(0%, 2%, 4%, 6%, 8%)菊粉-WPI連續相的熒光光譜。所有濃度的菊粉最高吸收峰的波長都出現明顯的紅移,低濃度菊粉熒光強度增加,使得WPI中色氨酸更多地在水中暴露,由于色氨酸的疏水性,疏水基團的暴露能夠增加乳液的穩定性,WPI在330 nm左右觀察到較強的熒光峰值,有菊粉的存在下,該峰值的幅度增加,說明了暴露于水相中的色氨酸基團增加。這種現象隨著菊粉濃度的下降而增加,可能原因是,菊粉的加入起到了靜電屏蔽作用,改變了色氨酸殘基周圍的疏水性,有研究表明[23],這種改變導致了一些原本位于WPI分子疏水內部的非極性基團暴露在周圍的水相中,復合物疏水性的增加,也就代表親脂性增加,而在沒有碳水化合物的情況下,乳清分離蛋白可能是依靠疏水相互吸引,因此疏水基團的暴露少。

a-SCI復合WPI;b-MCI復合WPI圖1 不同聚合度下不同濃度菊粉連續相的熒光光譜圖(P<0.05)Fig.1 Fluorescence spectra of composite WPI with different concentrations of inulin (P<0.05)

2.2 添加菊粉對粒徑以及絮凝指數的影響

為了對乳液中平均粒徑進行表征,制備了不同的乳液,油添加的質量分數都是一定的(10%)。圖2表示了不同聚合度下不同濃度菊粉對2%WPI乳液的平均粒徑大小與絮凝指數。乳液的粒徑對乳液穩定性有著很大的關系,通常粒徑越小,乳液擁有的穩定性就更好[24]。并且蛋白質-多糖產生的相互作用,比單獨使用一種蛋白質所制成的乳液擁有更好的穩定性[25]。圖2中所示的所有相同聚合度菊粉乳液隨著濃度的增大平均粒徑呈現了上升的趨勢,當菊粉質量分數為2%時,乳液的平均粒徑小于單獨使用WPI的平均粒徑2.44 μm,短鏈菊粉乳液和天然菊粉乳液均顯示出了最小的平均粒徑分別為2.24和2.29 μm,二者無明顯差異,說明菊粉質量分數在2%時,乳液擁有更好的穩定性,SCI和MCI乳液(2%、4%)的絮凝指數為0,說明了乳液的穩定性良好。當菊粉質量分數超過4%時,MCI乳液平均粒徑為2.84 μm超過WPI乳液且比同濃度的SCI乳液的平均粒徑大,可能原因是不同聚合度菊粉之間鏈長的影響,中鏈菊粉的聚合度大于短鏈菊粉,與其他物質復合后,如蛋白質,隨著菊粉聚合度的增加,粒徑呈上升趨勢[26]。在高質量分數菊粉乳液(6%、8%)中平均粒徑的大小超過了單獨使用WPI的乳液,菊粉質量分數為8%時,短鏈菊粉和中鏈菊粉乳液的粒徑分別為3.14和3.19 μm,粒徑增大的可能原因是樣品連續相黏彈性的增加和油滴大小有關[27],這一結果與連續相Zeta電位相一致,圖中樣品間的絮凝指數并無明顯差異。

圖2 不同濃度的SCI和MCI的WPI乳液平均粒徑和絮凝指數(P<0.05)Fig.2 Average particle size and flocculation index of WPI emulsion with different concentrations of SCI and MCI (P<0.05)

2.3 乳液微觀結構

圖3 不同濃度SCI和MCI的WPI乳液激光共聚焦顯微結構和粒徑分布圖Fig.3 Laser confocal microstructure and particle size distribution of WPI emulsion with different concentrations of SCI and MCI

由圖3所示,隨著菊粉濃度的增加,乳液粒度分級的寬度也隨之增加,低質量分數菊粉(2%)粒度分級的寬度小于對照組,且乳液液滴較小、大小分布均勻,并無油滴聚集的情況。反觀高質量分數菊粉(6%,8%)的乳液出現較大液滴且密集,可能原因是蛋白質-多糖的電荷屏蔽效應使分子間斥力減小從而使油滴相對聚集,這一微觀結構的結果與Zeta電位的分析一致。同時低質量分數菊粉乳液(2%)相較于對照組顯示出更小的粒徑分布,乳液的液滴分散性良好,短鏈菊粉質量分數為4%的乳液的粒徑分布圖同對照組相差無幾但略有聚集,此濃度下的中鏈菊粉乳液不同于短鏈菊粉乳液,粒徑分級與對照組無明顯差異,但從激光共聚焦的微觀結構結果顯示液滴較為密集,分散性較短鏈菊粉乳液差,這可能是中鏈菊粉的聚合度以及菊粉分子質量的差異所致,其結果與乳液平均粒徑結果一致,高質量分數菊粉乳液(6%、8%)CLMS顯示有液滴聚集,并出現了較大油滴的分布,這表明高濃度菊粉乳液穩定性不好。

2.4 乳液界面蛋白吸附量分析

蛋白質-多糖之間的界面相互作用對其特性有著直接的影響,其研究是表征乳液的基礎[31]。圖4表示了不同聚合度下不同質量分數菊粉(0%、2%、4%、6%、8%)乳液的界面蛋白吸附量,WPI質量分數為2%恒定不變,圖中WPI乳液界面蛋白吸附量為70.61%,所有短鏈菊粉并沒有對WPI在界面吸附量上顯示出明顯的差異,而中鏈菊粉質量分數從0%增加到2%時,界面蛋白吸附量有著明顯的增加,增加量達到6.65%,均高于所有濃度的菊粉乳液,這說明低質量分數(2%)的中鏈菊粉使WPI能夠穩定較大的界面面積,更多的蛋白質吸附在O/W界面上[32]。當中鏈菊粉質量分數從2%進一步增加到4%、6%,WPI界面蛋白吸附量為68.16%、68.43%其對WPI界面蛋白吸附量輕微下降,中鏈菊粉質量分數增加到8%時,WPI界面蛋白吸附量下降至64.34%,有研究表明,雖然菊粉對蛋白質的界面性質并無明顯的影響,但其對WPI的疏水基團暴露,使WPI能夠吸附較大的界面面積[33]。

圖4 不同濃度短鏈菊粉和中鏈菊粉的WPI乳液界面蛋白吸附量圖Fig.4 WPI interfacial protein adsorption capacity of short-chain inulin and medium-chain inulin at different concentrations

2.5 乳化性質分析

EAI和ESI反映了WPI-菊粉在油水界面吸附和乳狀液形成過程中油滴擴散和聚集的能力[28]。圖5研究了不同聚合度下不同質量分數的菊粉(0%、2%、4%、6%、8%)制成乳液的乳化性質。高壓均質機作用下的機械力暴露了更多蛋白表面的疏水基團[34],從熒光光譜分析疏水基團的暴露與菊粉濃度的高低有關,因此高壓均質后的低濃度菊粉乳液具有更高的乳化性。從圖5中可以看出隨著菊粉濃度的增加,乳液的EAI在2%(質量分數)下達到最高值5.734、5.689 m2/g而后下降,結合熒光光譜分析WPI-菊粉使得WPI的疏水基團暴露,使空間結構更舒展,說明在低濃度菊粉的環境下,WPI-菊粉乳液的穩定性增加,油滴分散。高濃度菊粉環境下,WPI-菊粉乳液的EAI為3.703 m2/g,乳化能力明顯降低,導致其乳化活性降低的原因是高濃度菊粉的加入使疏水基團暴露減少,其空間結構不如低濃度菊粉乳液舒展,乳化能力及穩定性差,這與激光共聚焦所顯示的微觀結構一致。短鏈菊粉和天然菊粉在低質量分數下(2%)對乳液的乳化穩定性影響最為顯著,乳液的ESI相比單獨使用WPI乳液的ESI 68.71%增加了9.59%以及8.55%,二者的乳化能力最好并無明顯差異,短鏈菊粉和天然菊粉質量分數為8%的乳液,其ESI分別為62.15%和60.34%,乳化能力與乳劑穩定性最差。

圖5 不同濃度短鏈菊粉與中鏈菊粉對乳液EAI和ESI的影響Fig.5 Effects of different concentrations of short chain inulin and medium chain inulin on the EAI and ESI of lotion

2.6 儲存過程中粒徑的變化

圖6顯示了顆粒體積(d4,3)和Sauter(d3,2)直徑在0、1、3、7、14 d存儲時間的變化函數。一般來講,d3,2作為與乳液不穩定過程相關的液滴尺寸變化的測定手段如液滴的聚集、絮凝等[35],也可以反映出乳液的乳化能力[36]。顆粒體積(d4,3)直徑的大小與乳液的穩定性相關,一般較小的粒徑具有較好的穩定性[34]。

圖6 不同濃度短鏈菊粉和中鏈菊粉儲藏14 d d4,3 以及d3,2的變化Fig.6 Changes in d4,3 and d3,2 of short chain inulin and natural inulin stored at different concentrations for 14 days

研究菊粉濃度對儲存中粒徑變化的影響時,低濃度菊粉乳液總是比單獨使用WPI乳液的粒徑小,所有短鏈菊粉乳液均表現出相當的抗聚集穩定性,因為顆粒體積(d4,3)直徑在這段時間內保持穩定,可能原因是蛋白-多糖吸附在油滴表面形成黃色環狀結構使油滴不容易聚集[29]。高濃度短鏈菊粉乳液在第14天有一定上升的趨勢,蛋白質分子在油滴表面吸附后,油水界面上展開重新排列,所導致的粒徑增大[37]。中鏈菊粉乳液除了低質量分數(2%)在儲存時間內相當穩定,其余的濃度梯度雖在前3天保持穩定,7 d后呈現了上升的趨勢,可能原因是天然菊粉的線性結構和分子的平均聚合度要高于短鏈菊粉[38],所以其平均粒徑要大于短鏈菊粉乳。圖6-c、圖6-d,d3,2低濃度短鏈菊粉、中鏈菊粉(2%)在14 d內保持著相同的態勢,擁有良好的乳化能力,另一方面,菊粉含量的增加導致d3,2的增加,這表明高濃度菊粉乳液乳化能力的降低。這些結果可能與之前發現的蛋白質疏水基團的暴露的多少有關,這與熒光光譜分析一致。

2.7 氧化穩定性分析

油脂的氧化酸敗影響著乳制品的口感和風味,圖7表示不同聚合度下不同質量分數菊粉(0%、2%、4%、6%、8%)對初級氧化產物的影響,油脂的氧化程度隨加速氧化時間而變深,橄欖油和乳液的氫過氧化物值不斷增大。從圖7中可以看出,短鏈菊粉的加入對油脂氧化有抑制作用,不同濃度短鏈菊粉乳液之間在前12天的氫過氧化物值并沒有很大差異。不同濃度的中鏈菊粉乳液6 d后的初級氧化產物值存在明顯差異,圖8表示不同聚合度下不同質量分數菊粉(0%、2%、4%、6%、8%)對次級氧化產物的影響,圖中橄欖油在50 ℃加速氧化的15 d內,次級氧化產物硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBARS)不斷升高,加入菊粉的樣品均低于橄欖油,短鏈菊粉乳液之間的TBARS值無明顯差異,從圖7、圖8中可以看出,中鏈菊粉乳液中菊粉質量分數在2%時氧化穩定性最好,其油脂氧化產物值最低,這是因為低濃度的中鏈菊粉增大了WPI在油水界面的吸附面積,能夠有效地減緩乳液中油脂的氧化[39]。此外,從激光共聚焦的結果來看,蛋白在吸附油滴時形成的環狀結構阻隔了介質中的氧化劑[29]。因此,中鏈菊粉質量分數在2%時,乳液的氧化穩定性最佳。

a-不同濃度SCI;b-不同濃度MCI圖7 不同濃度菊粉對初級氧化產物的影響Fig.7 Effects of different concentrations of inulin on primary oxidation products

3 結論

乳液中菊粉的存在改變了WPI原有的物理化學性質,WPI-菊粉的相互作用產生的效益影響乳液的穩定性。連續相的Zeta電位隨著菊粉濃度的增加,多糖對WPI產生的電荷屏蔽效益增大,Zeta電位的絕對值減小,低質量分數菊粉(2%,質量分數,下同)擁有良好的電動勢,對形成乳液后的穩定性起到良好的作用[36]。菊粉質量分數為2%時,乳液的平均粒徑最小,在14 d的儲存中顆粒體積(d4,3)和Sauter(d3,2)直徑均保持在相同的趨勢范圍內,并沒有明顯的增大,低濃度短鏈菊粉和中鏈菊粉的ESI分別增加了9.59%以及8.55%,其對WPI的乳化能力有明顯的提升。在15 d的加速氧化中,2%中鏈菊粉乳液表現出了更好的氧化穩定性。因此,短鏈菊粉和中鏈菊粉在2%時可以提高WPI乳液的乳化性以及穩定性,2%中鏈菊粉乳液具有更好的氧化穩定性。這些結果支持了商業食品乳液中使用菊粉等益生元成分,突出了其作為穩定劑的作用以及與所使用的乳化劑相互作用的重要性。