沉默信息調節因子2 介導蛋白質去乙?；c卵母細胞衰老

金清美，韓喬松，梁競男，周悅，孫振高，宋景艷

沉默信息調節因子（silence information regulator，sirtuin，SIRT）蛋白是一類進化保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）組蛋白脫乙酰酶，屬于Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC），SIRT2 是sirtuin 家族的一員，存在于卵母細胞細胞核和細胞質中，促進細胞成熟。研究發現，SIRT2 抑制會引起紡錘體缺陷、染色體錯位、氧化應激以及線粒體分布異常，導致卵母細胞減數分裂缺陷[1]。近年來，研究顯示衰老的卵母細胞中SIRT2 蛋白水平降低，紡錘體/染色體缺陷的頻率增加[2]。衰老的卵母細胞線粒體功能和紡錘體組裝異?？赡茏罱K導致卵母細胞非整體性增加[3]。卵母細胞非整倍體性是高齡女性生育能力下降的主要原因，增加了不孕、流產或胎兒先天性缺陷的風險，并且影響輔助生殖技術的助孕結局。一項回顧性研究顯示，卵母細胞非整倍體影響胚胎的發育潛力，在體外培養過程中，非整倍體胚胎比整倍體胚胎更容易在囊胚期之前發育停滯，且優質囊胚為整倍體的可能性高于非整倍體[4]。由此可見，SIRT2 精準調控細胞周期過程從而產生健康的卵母細胞，對高齡女性妊娠結局具有重要的意義。

1 SIRT2 在卵母細胞中的定位

蛋白質分子在細胞內準確的定位是其發揮功能的前提和基礎，細胞正常的生理活動與蛋白質的亞細胞定位密切相關。免疫組織化學（immunohistochemistry）和蛋白質印跡（Western blotting）結果顯示，SIRT2 在牛顆粒細胞、卵丘細胞、卵母細胞和卵膜細胞中均有表達[1，5]，SIRT2 在減數分裂期表達處于高水平狀態，尤其是在第二次減數分裂中期（metaphase Ⅱ，MⅡ）卵母細胞中[1]，因此，SIRT2 可能對牛卵泡的發育和成熟起重要作用。Ferreira 等[6]研究發現，隨著卵母細胞周期的進程不斷發展，SIRT2 從生發泡（germinal vesicle，GV）早期細胞質外周穿梭進入到GV2 期的細胞核中，調節異染色質和核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）基因沉默，此外，研究還發現SIRT2 在第一次減數分裂中期（metaphase Ⅰ，MⅠ）、第一次減數分裂后期（anaphase Ⅰ，AⅠ）和MⅡ期與紡錘體表現出很強的相關性，這表明SIRT2 可能在牛卵母細胞減數分裂過程中對紡錘體組裝具有重要的作用。由此可見，SIRT2 與卵母細胞減數分裂過程密切相關。

2 SIRT2 介導蛋白質去乙?；{控減數分裂過程

2.1 SIRT2 和間隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）Cx43 是細胞間隙連接通訊（gap junction intercellular communication）的主要介質，在卵巢中表達最為豐富，主要存在于顆粒細胞中[7]。眾所周知，間隙連接和旁分泌因子介導卵母細胞與顆粒細胞之間雙向信號通訊，促進卵泡的正常生長發育。

2020 年的一項研究顯示，SIRT2 通過絲裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinases，MEK）去乙?；种萍毎庑盘栒{節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）介導的Cx43 絲氨酸368 位點（Ser368）磷酸化，從而調控牛卵丘-卵母細胞復合體（cumulusoocyte complex，COC）的間隙連接通訊[8]。ERK1/2 介導的Cx43 Ser368磷酸化也是17β-雌二醇調控豬[9]和山羊[10]COC 間隙連接通訊的潛在機制，參與卵母細胞核成熟和減數分裂恢復。Cx43 Ser368 磷酸化會降低原代和永生化人顆粒黃體細胞（human granulosa lutein cell）間隙連接通訊的活性[11]。既往研究表明，間隙連接通訊維持卵母細胞內適當的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，有利于GV 期卵母細胞染色質重塑和轉錄調控[12]。卵母細胞內cAMP 減少觸發的減數分裂恢復與Cx43 磷酸化增加介導的間隙連接通訊關閉相關。抑制牛COC 中SIRT2 活性，過早破壞Cx43 介導的間隙連接通訊，反而會阻礙卵母細胞核成熟，影響卵母細胞發育能力[8]。這可能是因為提早關閉間隙連接通訊影響營養物質和信號分子向卵母細胞輸送，卵母細胞內cAMP 水平過早降低影響染色質結構和功能的分化。有研究顯示，誘導卵母細胞體外成熟（in vitro maturation）前，使用cAMP/環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）調節劑人工維持減數分裂阻滯可以提高體外成熟卵母細胞發育能力，cGMP 通過抑制磷酸二酯酶3（phosphodiesterase 3，PDE3）對cAMP 的分解，從而抑制促成熟因子（maturation promoting factor）的活性以維持GV 階段的減數分裂阻滯，延長卵母細胞-卵丘細胞間隙連接通訊，并允許時間賦予卵母細胞在核成熟之前的發育能力[13]。卵泡抑素（follistatin）通過抑制cGMP 的降解和暫時延遲核成熟挽救了體外成熟質量較差的豬卵母細胞發育至囊胚期的能力[14]。

由此可見，卵母細胞減數分裂受SIRT2/MEK/ERK/Cx43 信號通路調控。此外，SIRT2 還可以直接介導Cx43 去乙?；瘉砭S持Cx43 在卵丘細胞上的膜定位，從而調控牛COC 中的間隙連接通訊[8]。

2.2 SIRT2 和組蛋白H4 第16 位賴氨酸（H4K16）組蛋白H4K16 的乙?；钦婧松镏衅毡榇嬖诘目赡娴姆g后染色質修飾，摻入核小體陣列可抑制致密30 納米樣纖維的形成，具有阻礙染色質形成交叉纖維相互作用的能力[15]。缺乏HDAC2 的小鼠H4K16乙?；黾?，可能會導致染色體在卵母細胞成熟過程中不能完全凝集，并損害著絲粒功能[16]。2020 年一項研究顯示，通過SIRT2 介導H4K16 去乙?；軌驕p少小鼠卵母細胞著絲點和微管（kinetochoremicrotubule）異常結合及染色體分離錯誤，挽救生殖年齡相關的卵母細胞缺陷表型[2]。小鼠卵母細胞中染色體凝集和著絲粒功能缺陷與H4K16 高乙?；鸾M蛋白H3 第3 位蘇氨酸（H3T3）磷酸化和組蛋白H3 第10 位絲氨酸（H3S10）磷酸化水平降低有關[17]。H4K16 乙?；?、H3T3 磷酸化和H3S10 磷酸化間交叉對話也存在于豬卵母細胞，影響著絲點-微管的穩定性、著絲點的拉力以及mRNA 的轉錄[18]。在人腫瘤細胞中發現，抑制組蛋白去乙?；档土酥z粒組蛋白H3S10 的磷酸化水平，在S 期添加組蛋白去乙?；种苿е掠薪z分裂S 期和G2 期著絲粒區上異染色質蛋白1-β（heterochromatin protein 1-β，HP1-β）降低，減少了極光激酶B（aurora kinase B）在著絲粒上的定位，極光激酶B 可以催化組蛋白H3S10磷酸化，從而導致著絲粒組蛋白H3S10 磷酸化水平降低，隨后M 期著絲粒組裝出現缺陷；該研究還發現，抑制組蛋白乙?；?，hBUB1、著絲粒蛋白F（centromere associated protein F，CENP-F）和CENP-E在細胞著絲粒上表達減少[19]。在有絲分裂和減數分裂過程中H3T3 磷酸化能夠將染色體移動復合體（chromosomal passenger complex）招募到內著絲粒上糾正著絲點-微管的異常結合，其催化成分是極光激酶B，而極光激酶B、內著絲粒結合蛋白（inner centromere protein，INCENP）、存活蛋白（survivin）和Borealin/Dasra B 等蛋白分子組成染色體移動復合體，調控著絲粒的功能[20-21]。

此外，卵細胞減數分裂過程中，DNA 的損傷也會影響卵母細胞的質量。最近研究發現，SIRT2 介導H4K16 去乙?；切迯桶┘毎鸇NA 損傷的新途徑，SIRT2 通過與牛痘病毒相關性激酶1（vaccinia virus associated kinase 1，VRK1）相互作用，抑制MYST 組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）家族中的TIP60（tat interacting protein 60 kD）/賴氨酸乙酰轉移酶5（lysine acetyltransferase 5，KAT5）的活性，介導H4K16 去乙?；?，過量的H4K16 乙?；瘯е氯旧|松散和染色質可接近區域DNA 損傷并干擾DNA 修復途徑[22]。

2.3 SIRT2 和α-微管蛋白（α-tubulin）微管是α-微管蛋白和β-微管蛋白動態聚合形成的細長管狀的細胞骨架結構，調節細胞分裂、細胞遷移以及細胞內運輸等細胞生命活動。微管結構和功能的多樣性受微管蛋白翻譯后修飾調控，常見的有乙?；?、泛素化、磷酸化和甲基化等，α-微管蛋白乙?；悄壳把芯孔疃嗟奈⒐艿鞍追g后修飾，其乙?；稽c位于微管腔內第40 位賴氨酸上，與細胞環境中微管穩定性相關[23]。

研究發現，驅動蛋白家族成員15（kinesin family member 15，KIF15）[24]、RAB23/KIF17[25]以及KIF18A[26]可以通過SIRT2 調控小鼠卵母細胞α-微管蛋白乙?；?，影響微管的穩定性。SIRT2 水平增加導致小鼠α-微管蛋白乙?；浇档?，破壞微管的穩定性和著絲點-微管結合，導致紡錘體/染色體缺陷，產生非整倍體卵母細胞[27]。但通過抑制卵母細胞中SIRT2 活性引起α-微管蛋白乙?；竭^度增加反而會導致牛[1]和小鼠[28]卵母細胞紡錘體/染色體缺陷。α-微管蛋白乙?；瘻p少了α-α 或β-β 橫向接觸，削弱了原絲之間的相互作用，降低成核頻率，加速微管收縮[29]，原絲之間較少的相互作用增加了微管的靈活性，使得微管抗機械應力的能力增強[29-30]。微管過于穩定使微管動力學失衡，可能也會導致小鼠卵母細胞減數分裂過程中紡錘體組裝缺陷[31]。由此可見，α-微管蛋白乙?；降钠胶庹{節微管的穩定性和微管動力學，對紡錘體正常組裝和染色體正確分離至關重要，但目前對于α-微管蛋白高乙?；绊懳⒐軇恿W存在爭議，有待進一步研究。

2.4 SIRT2 和BUBR1BubR1（bub-related 1）是酵母細胞有絲分裂監測點基因家族Mad3（mitotic arrest-deficient 3）的同源基因，是紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）的重要組成部分，SAC 監控著絲粒和紡錘體微管連接以確保細胞分裂過程中染色體正確分離。BUB1 和BUBR1 的主要作用是感受有絲分裂姐妹染色單體著絲點上的張力[32]。

老年小鼠卵母細胞中SIRT2 蛋白丟失，導致BUBR1 賴氨酸243 位點（BUBR1-K243）高乙?；?，損害了著絲點-微管之間的相互作用，引起紡錘體/染色體缺陷以及產生非整倍體卵子[33]。破壞微管穩定性和著絲點-微管附著會誘導SAC 蛋白激活，擾亂小鼠卵母細胞減數分裂中的細胞周期進程[34]。SAC首先被單極紡錘體1（monopolar spindle 1，MPS1）激酶激活，MPS1 激酶觸發有絲分裂檢查點復合體（mitotic checkpoint complex，MCC）的募集和形成，MCC 由MAD1、MAD2、BUB3 和BUBR1 組成，隨后，MCC 擴散到細胞質中并隔離細胞周期分裂蛋白20（cell division cycle 20，CDC20），CDC20 是一種后期促進復合物/細胞周期體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）的激活劑，抑制了分裂后期APC/C 的活性，從而抑制細胞周期蛋白B（cyclin B）和分離酶抑制蛋白（securin）的泛素化和降解，最終導致細胞周期阻滯，直至著絲粒正確附著在微管上[35]。既往研究發現，隨著年齡增長，人單個卵母細胞中BUB1B的平均轉錄水平逐漸降低，39 歲患者BUB1B 平均轉錄水平比31 歲患者減少了1.5 倍，BUB1B 轉錄水平的下降顯著降低了BUBR1 蛋白水平[36]。衰老的卵母細胞中BUBR1 蛋白水平的降低破壞了SAC 的功能，SAC 反應減弱，即使是未附著的著絲點也會導致分裂后期開始，導致染色體分離錯誤，產生非整倍體卵子。老年小鼠體內BUBR1 蛋白水平的降低與NAD+和SIRT2 維持BUBR1 賴氨酸668 位點（BUBR1-K668）處于去乙?；癄顟B的能力下降有關，通過SIRT2 過表達或用NAD+前體煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）處理可以增加BUBR1 的蛋白水平[37]，該位點的乙?；龠M了BUBR1 的泛素化和降解，通過SIRT2 可以逆轉BUBR1-K668 的乙?；?，從而保護BUBR1 免受泛素化和降解的作用[38]。除了上述泛素－蛋白酶體系統作用外，Goutas 等[39]對BUB1B/BUBR1 降解途徑提出了新的觀點，在細胞衰老過程中，蛋白酶體功能隨著細胞衰老而衰退，BUB1B/BUBR1 從依賴蛋白酶體降解向選擇性自噬降解轉變，選擇性自噬降解BUB1B/BUBR1 促使細胞衰老開始，可以避免細胞向癌細胞轉化，為有絲分裂錯誤驅動衰老的機制提供了見解。

由此可見，SIRT2 可能通過調控卵母細胞內BUBR1 蛋白水平參與減數分裂過程。但Lagirand-Cantaloube 等[40]發現，高齡婦女卵母細胞中BUBR1蛋白水平是恒定的，這一結果與上文相矛盾，這可能是兩者的研究對象卵母細胞群存在差異，從而導致結果不同，除此之外，研究中還發現BUB1 和BUBR1 在著絲點上的定位隨著年齡的增長而減少，這可能導致卵母細胞為非整倍體。

2.5 SIRT2 和叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a，FOXO3a）FOXO 是調控細胞周期進程、DNA 修復、抗氧化損傷和細胞凋亡的轉錄調節因子，FOXO蛋白家族的功能是由翻譯后修飾調節的，包括磷酸化、乙?；?、泛素化和甲基化等，微管蛋白翻譯后修飾受不同細胞應激的影響作用于FOXO 蛋白，調控其亞細胞定位、轉錄活性以及DNA 結合特性等[41]。

FOXO3a 是SIRT2 的靶點之一，SIRT2 介導的FOXO3a 去乙?；c大鼠大腦細胞衰老、凋亡以及氧化應激密切相關[42]。在氧化應激作用下，SIRT2 通過去乙?；疐OXO3a 增加小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）FOXO3a 的核定位以及與DNA 結合的活性，上調FOXO3a 靶基因細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B（cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，p27Kip1）、錳超氧化物歧化酶（mananese superoxide dismutase，Mnsod）和Bcl-2 樣蛋白11（Bcl-2-like protein 11，Bim）的表達[43]。在牛卵母細胞體外成熟過程中也觀察到了相似的結果，SIRT2 介導的FOXO3a去乙?；龠M了FOXO3a 核定位和轉錄活性，隨后超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2）和過氧化氫酶（catalase）的表達增加[1]。卵母細胞對氧化應激的響應可能是通過SIRT2 介導的FOXO3a 去乙?；瘉碚{節的。FOXO3a mRNA 表達水平在GV 破裂、MⅠ和MⅡ期明顯升高，在MⅡ期達到高峰，與年輕小鼠相比，老年小鼠FOXO3a 的表達水平顯著升高，并在MⅡ期普遍定位于染色質[44]。由此可見，衰老的卵母細胞處于一定的氧化應激，SIRT2 對衰老的卵母細胞的影響可能是通過FOXO3a 去乙?；瘯和＜毎芷谶M程，允許細胞分裂之前修復DNA 損傷并去除活性氧，從而改善卵母細胞的質量。

3 結語

SIRT2 對卵母細胞成熟至關重要，SIRT2 通過對Cx43、組蛋白H4K16、α-微管蛋白、BUBR1、FOXO3a等蛋白質直接和間接去乙?；饔?，調控減數分裂恢復、紡錘體組裝、染色體凝集和排列、氧化應激以及線粒體功能和分布等活動，以獲得健康的卵母細胞。目前研究發現，隨著年齡增長，卵母細胞中SIRT2 水平降低，容易引起減數分裂缺陷，而減數分裂缺陷產生的非整倍體卵母細胞是高齡女性生育能力下降的主要原因。因此，提高高齡女性卵母細胞中SIRT2 水平對獲得高質量的卵母細胞具有重要的意義，但目前對于SIRT2 調控卵母細胞減數分裂過程的相關機制尚不清楚，有待進一步研究。