亮菌多糖體外模擬消化-酵解特性及其益生作用探究

張煜琛,杜敏如,趙洪玥,楊舒郁,連玲丹,王杰

(華南農業大學 食品學院 食品功能微生物實驗室,廣東 廣州,510642)

多糖作為天然高分子聚合物在自然界中廣泛存在,其活性功能逐漸被證實,包括但不限于抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等。研究表明,非淀粉類天然多糖并不易被哺乳動物唾液降解,在小鼠實驗中,發現僅有少數種類多糖會在胃腸消化液作用下降解,且程度較低[1]。深入研究發現,幾乎所有多糖在抵達大腸時,可被共生細菌發酵利用,并產生大量小分子物質,被宿主吸收影響健康。LAGAMM等[2]研究證實,短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)在人體內發揮重要作用,不僅是腸道上皮細胞生長的物質能量,還可以維持電解質平衡,同時還具有抗炎、預防肥胖等作用,這也為臨床治療提供重要解決思路。

亮菌(Armillariellatabescens)作為傳統食藥用真菌同樣具有極高的活性利用價值,如其抗腫瘤生物功能被多位研究人員證實[3-6]。故探究高活性亮菌多糖在消化進程中的活性變化及對機體潛在的作用方式尤為重要。體外模擬消化及酵解具有操作便捷快速的特點,已成為近年來輔助研判食品或藥品體內消化吸收過程的常用手段。

因此,本研究將探究在體外模擬消化及酵解過程中,亮菌多糖的變化軌跡以及生物活性改變情況,為探究亮菌多糖在體內可能發生的活性改變進行初步驗證,同時為亮菌多糖作為益生元類產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亮菌,中國林業微生物保藏管理中心(CFCC 872604);雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌,均由華南農業大學食品學院食品功能微生物團隊保藏。大孔樹脂25A-210,西安藍曉科技新材料股份有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、乙酸、丙酸、丁酸,上海麥克林生化科技有限公司;ABTS試劑盒,索萊寶生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和過氧化物酶(peroxidase, POD)試劑盒,南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

R-1001VN型旋轉蒸發儀,鄭州長城科工貿有限公司;UV-1100紫外光分光光度計,上海美浦達儀器有限公司;Agilent 7890A/5975c型氣-質聯用分析儀,安捷倫(科技)中國有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 亮菌胞外多糖(Armillariellatabescensextracellular polysaccharide, ATEP)提取與純化

PDA培養基180 r/min,25 ℃發酵亮菌12 d。濃縮發酵液后1∶4(體積比)混合95%(體積分數)乙醇。4 000 r/min離心20 min,收集沉淀。大孔樹脂浸潤活化[7],沖洗ATEP,收集洗液。Sevag法[8]除蛋白,移出上層溶液-80 ℃真空冷凍干燥保存。多糖得率為ATEP醇沉質量與發酵上清液的比值。

1.3.2 ATEP理化分析

1.3.2.1 分子質量

樣品和標準品并配制成5 mg/mL溶液,12 000 r/min離心10 min,0.22 μm濾膜過濾后進行高效凝膠滲透色譜(high-performance gel permeation chromatography,HPGPC)分析。色譜條件:BRT105-104-102凝膠柱(8 mm×300 mm);流動相0.05 mol/L NaCl溶液;流速0.6 mL/min,柱溫40 ℃;進樣量20 μL。

1.3.2.2 單糖組成

5 mg樣品加入2 mL 3 mol/L三氟乙酸溶液,120 ℃水解3 h。吸取酸液,N2吹干,加入5 mL H2O混勻,吸50 μL加入950 μL水,12 000 r/min,5 min。上清液進行離子色譜(ion chromatography,IC)分析。

色譜條件:Dionex CarbopacTMPA20 (3 mm×150 mm);流動相:A:H2O;B:15 mmol/L NaOHC溶液:15 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOAC溶液;流速0.3 mL/min;進樣量5 μL;柱溫30 ℃;電化學檢測器。

1.3.2.3 ATEP主要組成成分

參照YANG等[4]苯酚硫酸法檢測總糖含量,KASIRG等[9]二硝基水楊酸法檢測還原糖,SAEED等[10]福林酚法檢測總酚,ZAMEER等[11]Na2NO2-Al(NO3)3-NaOH比色法檢測類黃酮,分別測定490、540、510、760 nm處吸光值,繪制標曲(圖1),配制100 mg/mL ATEP檢測后代入方程計算,所得含量與多糖溶液濃度之比即為質量百分比。

a-總糖;b-還原糖;c-總酚;d-總黃酮

1.3.3 體外抗氧化活力

SOD、CAT、POD及ABTS按照試劑盒說明書操作。DPPH參照[12]方法檢測。配制濃度梯度維生素C標準液,反應后在517 nm處測定吸光度,計算如公式(1)所示。

(1)

式中:A1,實驗組測得的吸光值;A0,對照組測得的吸光值;A2,空白組測得的吸光值,同時維生素C作為陽性對照。

總還原力參照CHEN等[13]的方法。樣品中加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、5%(質量分數)K3[Fe(CN)6],10%(質量分數)的三氯乙酸溶液,等體積H2O和0.1% FeCl3混勻,振蕩后靜置,700 nm處測吸光度,實驗組與對照組差值即為還原力。

1.3.4 “唾-胃-腸”體外模擬消化[14]

經口消化:收集志愿者唾液(9男,16女;3個月內未服用任何藥物與酒精飲料),4 ℃離心15 min,上清液與10 mL ATEP等量混合,37 ℃水浴20 min后滅活;其余消化產物調節pH值為1.3±0.1,備用。經胃消化:將模擬經口消化產物1∶1(體積比)混合模擬胃液,37 ℃水浴3 h后滅活。其余消化產物加入NaOH調節pH值為6.8±0.1,備用。經腸消化:將模擬經胃消化產物3∶1(體積比)混合模擬人工腸液,37 ℃水浴4 h后滅活待測。

1.3.5 益生菌活化及生長曲線測定

參照ZHANG等[15]方法,受試菌種接種于添加有10%(體積分數)1 mg/mL ATEP溶液的MRS培養基,37 ℃恒溫厭氧培養0、2、6、12、24、48 h測定OD600與pH值,繪制生長曲線。

1.3.6 體外模擬酵解

收集4名志愿者(2男,2女,3個月內未服用任何藥物)新鮮糞便,等量混勻,厭氧條件1∶10(體積比)加入無菌生理鹽水(含 0.5 g/L的L-鹽酸半胱氨酸溶液),0.8 μm過濾雜質。10%比例接種至酵解培養基[16],終質量濃度為10 mg/mL的ATEP溶液,培養24 h和48 h后,立即冷凍離心(10 000×g,10 min),上清液用于分析pH值與SCFAs含量。

1.3.7 SCFAs含量[17]

取酵解產物加入等量乙酸乙酯,渦旋2 min,離心15 min,取600 μL上層液上機。

GC-MS條件:Agilent DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mmID×0.25 μm),初始溫度90 ℃,10 ℃/min上升到 120 ℃,5 ℃/min上升到150 ℃,25 ℃/min上升到250 ℃保持2 min,He載氣,流速1.0 mL/min,分流比10∶1。繪制標準曲線(表3),計算ATEP中含量。

1.3.8 數據統計與分析

試驗與檢測重復3次。SPSS 25.0進行比較平均值單因素ANOVA檢驗進行差異顯著性分析,數據結果用平均值±標準差表示,采用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 ATEP得率與理化性質

ATEP胞外多糖含量為724.8 mg/100 mL,提取后ATEP得率為9.03%,其中總糖占43.52%質量分數,還原糖為0.76%,總酚為0.23%,總黃酮為0.96%。如圖2所示ATEP由兩組分組成,分子質量分別為27.0 kDa和8.9 kDa。ATEP的單糖分析顯示(表1),由巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖構成,摩爾比為0.036∶0.008∶0.315∶0.522∶0.019∶0.099。

表1 ATEP單糖組成分析結果Table 1 Monosaccharide compositions of ATEP

圖2 ATEP分子質量HPGPC法分析結果Fig.2 Analysis results of ATEP molecular weight by HPGPC

2.2 ATEP模擬消化過程營養成分變化規律

如圖3所示,ATEP的總糖、還原糖、總酚、總黃酮在依次經歷模擬經口、經胃、經腸消化后,變化量不同。其中總糖和還原糖消化前、消化中、消化后含量未發生顯著改變(P>0.05)。推測多糖分子無法被人體自泌消化酶降解,經口食入至離開小腸時幾乎未變化,糖苷鍵未發生明顯斷裂[18]。而總酚含量模擬經胃后得到顯著提高(P<0.05)?？傸S酮僅在模擬經腸后含量顯著升高(P<0.05),可能由于胃液與腸液可少量作用ATEP分子;另外,也可能與ATEP所含雜質有關,雜質被胃腸消化系統改造,并提升了產物總酚與總黃酮量。

a-總糖;b-還原糖;c-總酚;d-總黃酮

2.3 ATEP消化產物抗氧化力的變化

由圖4可知,在經歷了模擬“唾-胃-腸”作用后,產物抗氧化力出現增強效果。與ATEP對照相比,模擬消化后產物,ABTS和DPPH清除率,抗氧化酶活力顯著升高(P<0.05),總還原力消化后極顯著增強(P<0.001)。

2.4 體外酵解過程中產物變化規律

體外模擬酵解反應是補充人體內消化道大腸段消化過程,該路徑為宿主腸道細菌的主要聚居地,隨消化向下行徑,微生物數量和種類的豐富程度陡增。根據圖5可知,在48 h的模擬酵解過程中,ATEP作為重要碳源,隨著時間的延長被微生物持續酵解,碳水化合物消耗量不斷上升(圖5-a)。在此發酵過程中,以看到還原糖含量在前12 h表現出持續上升積累,但隨后急速下降,分析在此過程中,多糖糖苷鍵被破壞,降解為小分子糖類,如還原糖;隨后,還原糖又會成為下游細菌的能量來源代謝并轉換成其他小分子物質,如短鏈脂肪酸等。與此同時,酵解的進行使微環境酸度上升,酵解前pH 8.2,酵解中pH不斷下降至終止時為5.1。

a-碳水化合物消耗量;b-還原糖含量;c-pH

2.5 ATEP促進益生菌增殖

如圖6-a～圖6-d所示,ATEP表現出對雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌及大腸桿菌均有促生長促增殖的作用。添加ATEP后,4種菌在培養48 h時密度均大于對照組。其中,雙歧桿菌和植物乳桿菌在培養12 h后,這種促生長作用表現出來,而干酪乳桿菌和大腸桿菌則在培養6 h就有體現。培養環境pH的變化不斷下降,從8.1下降至5.6(圖6-e～圖6-h)。相同培養時長下,ATEP對pH影響輕微。

a-雙歧桿菌OD值;b-植物乳桿菌OD值;c-干酪乳桿菌OD值;d-大腸桿菌OD值;e-雙歧桿菌pH;f-植物乳桿菌pH;g-干酪乳桿菌pH;h-大腸桿菌pH

2.6 ATEP對SCFAs發酵產量的影響

標準物質曲線回歸方程見表2。如圖7所示,ATEP對SCFAs促進影響極顯著(乙酸P<0.001;丙酸、丁酸P<0.005)。與對照相比,酵解結束后乙酸含量增長13倍,增幅1 200%,丙酸和丁酸含量增加2倍。

表2 三種SCFA標準物質GC-MS分析結果Table 2 GC-MS analysis results of three SCFAs reference materials

圖7 經模擬酵解后發酵物SCFAs產量Fig.7 Production of SCFAs after simulated fermentation

3 討論

天然多糖根據其單糖、糖苷鍵類型的多樣而表現出不同活性。靈芝中提取的D-葡聚糖具有較高抗氧化力[19],杏鮑菇多糖主要由葡萄糖組成,比例可達78.32%,因而表現出較好的胰島素耐受力[20]。體外模擬消化基于減少傷害實驗動物,可重復等優點,近年來被研究者們廣泛使用。梁美香等[21]對柑橘果膠進行體外模擬消化后,其產物抗氧化活性提高,對4種益生菌具有較好的促進增殖作用。本文中ATEP經“唾-胃-腸”模擬消化后并沒有顯著提高產物抗氧化活性,與YUAN等[22]對馬尾藻多糖處理后自由基清除力降低類似,但相同處理后,馬齒莧抗氧化活性得到增強[23]。

在體內消化系統中,α多糖(如淀粉)可被自身消化酶水解,同時受膽鹽等化合物影響,α多糖理化性質容易被改變,進而被人體利用[24]。但天然多糖,特別是具有藥用價值的活性多糖,其支鏈的β多糖并不能直接利用[25],而是在細菌的作用下逐漸水解為小分子物質方可被吸收,如短鏈脂肪酸。本研究中ATEP經模擬酵解可增加SCFAs,特別是乙酸含量,且對雙歧桿菌、干酪乳桿菌具有促進增殖的益生作用。XIE等[26]認為,體外發酵可表征人類腸道微環境代謝各類食物的能力,并據此設計和制造有針對性的功能食品。

4 結論

本研究中ATEP總糖質量占比43.52%,在抗氧化方面,自由基清除率與抗氧化酶系均有較強作用。體外模擬消化顯示,人體自有消化酶幾乎不能對ATEP進行降解,但人體寄生細菌卻對ATEP表現出較高喜好與利用率。ATEP在腸道微生物作用下發生不同程度水解,一方面為微生物生長提供能量物質來源,一方面經其代謝可轉換為對人體有用的小分子短鏈脂肪酸。本試驗選用的4種益生菌在無氧條件下的生長同樣表現出對ATEP的依賴。這些說明ATEP作為天然來源真菌多糖,通過腸道微生物利用,產生了多種代謝產物,并對人類健康有重要意義。