三種單萜對皿式培養樟芝三萜合成的影響

李心陽,羅志珊,耿燕,任怡琳,許泓瑜,史勁松,陸震鳴*,許正宏

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫,214122)

樟芝(Antrodiacinnamomea),又名牛樟芝,屬于擔子菌門、多孔菌科、薄孔菌屬,是一種藥食兩用真菌[1]。樟芝具有多種藥理成分,包括三萜類化合物、多糖、泛醌類化合物、馬來酸和琥珀酸的衍生物、腺苷等[2-5]。藥理研究表明,樟芝具有抗癌、保肝、抗炎、免疫調節、神經保護等生物活性[6-9],因此樟芝具有的極高藥用價值,市場需求極大,但是野生樟芝子實體數量稀少、采集不易。皿式培養是人工培養樟芝菌絲體的重要方式之一,培養周期比椴木栽培法短,但是皿式培養菌絲體三萜的產量仍與野生子實體三萜產量有較大的差距[10]。

目前已有多種方式提高樟芝皿式培養菌絲體的三萜產量,包括改善培養基的組成與配比、添加樹木及草藥的浸出液以及添加刺激因子等。魯東大學馮路瑤等[11]研究發現樟芝在胡蘿卜培養基(胡蘿卜200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L,pH自然)和葡萄糖酵母浸粉蛋白胨培養基(葡萄糖20 g/L、蛋白胨6 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂15 g/L,pH自然)上培養的菌絲中總三萜含量較高,且適合三萜積累的碳源有葡萄糖、麥芽糖和甘露糖等,適合三萜積累的氮源有(NH4)2SO4和魚蛋白胨等。福建農林大學李晶等[12]研究發現不同菌草浸出液對樟芝皿式培養菌絲體總三萜含量促進作用由大到小排列順序為:香茅草、巨菌草、憂遁草、紫色象草、象草。且香茅草浸出液顯著促進漆酶、谷氨酸合成酶合成,顯著促進AcHMGS、AcHMGR和AcSE表達,能作為牛樟芝菌絲體培養基,促進菌絲體生長和三萜含量積累。另外,多種刺激因子已被證明具有促進樟芝皿式培養菌絲體三萜生成的作用,廣西中醫藥大學李一凡等[13]研究發現植物激素生長素可以顯著促進樟芝皿式培養菌絲體三萜的產量,添加0.5 mg/L時有最大的三萜產量133.24 mg/L,較對照組提高了61.31%;并且添加牛樟樹粉末對牛樟芝菌絲體粗三萜產量提升作用明顯,在添加質量濃度為0.5 mg/L時,三萜產量為98.87 mg/L,較對照組提升了84.26%。ZHANG等[14]研究了一種單萜α-松油醇對樟芝皿式培養菌絲三萜生成的影響,發現α-松油醇的最佳添加量為0.05 mL/L,三萜產率達到32.52 mg/g。

本研究評價存在于牛樟樹揮發性化合物中[15]的3種單環單萜(4-萜烯醇、α-松油烯和松油烯)(圖1)對樟芝皿式培養的影響。首先比較了3種單萜對樟芝皿式培養三萜生成的影響,再通過LC-MS分析各物質最佳添加濃度下菌絲體三萜組成的變化,為提高樟芝人工培養三萜生產的效率提供新思路以及實踐依據,具有較大的開發價值及應用前景。

圖1 樟芝皿式培養生長曲線Fig.1 Growth curve of Antrodia cinnamomea cultured in petri-dish

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要材料與試劑

樟芝菌株ATCC 200183,實驗室保存。

齊墩果酸、α-松油醇,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;香蘭素、冰醋酸、高氯酸,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈(HPLC級),上海麥克林生化科技股份有限公司;4-萜烯醇、松油烯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基,日本榮研生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

UV-1600紫外可見分光光度計,上海翱藝儀器有限公司;GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱,上海博訊實業有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺,吳江市金曉空調凈化有限公司;WATERS ACQUITY超高效液相色譜儀、WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS質譜儀,沃特世科技(上海)有限公司;有機微孔濾膜(0.22 μm),天津市領航實驗設備股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的保存及活化

牛樟芝的菌絲體保存在體積分數30%的甘油中,置于-80 ℃冰箱內長時間保存。取邊長為1 cm的菌絲接種至含有PDA培養基的斜面中,置于26 ℃的恒溫培養箱中避光培養20 d,待菌絲長滿培養基表面,菌種活化完成。用直徑為0.8 cm的凝膠打孔器從斜面中取下圓形的菌塊,接種至含PDA培養基的平皿中央,置于26 ℃的恒溫培養箱中避光培養30 d,待菌絲長滿培養基表面,獲得實驗接種的初始培養菌絲。

1.2.2 樟芝皿式培養時間的確定

用直徑為0.8 cm的打孔器從初始平板上取菌絲置于含有PDA培養基的平皿中,置于26 ℃的恒溫培養箱中培養。分別在培養第5、15、25、35、45天取樣,分離菌絲與培養基并記錄菌絲干重,測量菌絲的三萜含量以及三萜組成的變化情況。

1.2.3 不同濃度單萜對樟芝皿式培養的影響

在PDA培養基凝固前加入不同質量濃度的單萜(0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g/L),混勻,待培養基凝固后,接種直徑為0.8 cm的樟芝菌絲至平皿中央,置于26 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.4 樟芝菌絲體生物量的測定

分離每組菌絲體與培養基,將菌絲體置于50 ℃烘箱中干燥至恒重,測定干重,得到每組樟芝菌絲體生物量。

1.2.5 樟芝菌絲體三萜含量的測定

采用香草醛-高氯酸法進行測定。精確稱取香草醛0.50 g于10 mL的容量瓶中,用冰醋酸定容,得到50 g/L的香草醛-冰醋酸溶液;精確稱取4 mg齊墩果酸對照品于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到質量濃度為0.4 mg/mL的齊墩果酸標準液,分別吸取上述標準溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于20 mL比色管中,100 ℃水浴蒸干溶劑,加入0.3 mL的香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸溶液,60 ℃水浴20 min,反應后的溶液置于冰水中冷卻,加入10 mL的冰醋酸溶液,搖勻后測定溶液在550 nm下的吸光值,以齊墩果酸的含量為X,吸光值為Y,繪制標準曲線為Y=4.790 8X-0.003 6,R2=0.998 5。實驗中各組樟芝干燥后的菌絲體用2 mL甲醇超聲波提取三萜類物質,超聲波功率400 W,溫度50 ℃,提取120 min,得到的溶液用0.22 μm的有機微孔濾膜進行過濾,取200 μL濾液置于20 mL比色管中,按照上述測定操作測定吸光值,并根據標準曲線計算總三萜含量。

1.2.6 樟芝菌絲體三萜組成變化的檢測

采用LC-MS法對樟芝菌絲體三萜組成進行檢測,與文獻中各三萜的質譜信息進行對比,確定液相圖譜中各峰的信息[16]。超高效液相色譜儀型號,WATERS ACQUITY;液相色譜柱型號,Shim-pack XR-ODS Ⅲ 2.2 μm,2.0 mm × 15 cm;液相檢測條件:流動相,乙腈、0.01%磷酸-水溶液;進樣量10 μL;柱溫50 ℃;流速0.5 mL/min;檢測波長254 nm;時間程序,0～15 min,30%～80% 乙腈;內標化合物,香蘭素。質譜儀型號:WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS;質譜檢測條件:離子方式ESI-;毛細管電壓3.5 kV;錐孔電壓30 V;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣溫度400 ℃;碰撞能量6/20 V;質量范圍20～2 000m/z;電壓1 800 V。

1.3 數據分析

采用Origin 2021對結果進行單因素方差分析,所有實驗重復3次,生物量和三萜產率以平均值±標準差表示。采用SPSS對結果進行顯著性分析,P<0.05表示差異具有統計學意義;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 樟芝生長曲線的測定

在樟芝皿式培養不同時間取樣,檢測菌絲體生物量與三萜產率,繪制樟芝皿式培養生長曲線(圖1)?？梢钥闯?樟芝皿式培養5～25 d是菌絲快速生長的時期,25 d之后樟芝生長速率減慢;培養5 d后三萜開始積累,在培養25～35 d是三萜快速積累的時期。培養35 d后樟芝菌絲體生長速率和三萜合成速率開始減慢,因此在本研究中選擇35 d作為樟芝皿式培養的時間。

2.2 不同濃度單萜對樟芝皿式培養的影響

α-松油醇的添加質量濃度在0.04～ 0.12 g/L時,對樟芝皿式培養菌絲生長具有顯著的促進作用;添加質量濃度為0.08 g/L時,生物量達到最大值165.67 mg/板,且三萜產率顯著提升,達到最大值17.55 mg/g,較對照組提高了50.39%(圖2-a)。4-萜烯醇在試驗濃度范圍內并沒有對樟芝皿式培養生長產生明顯的促進作用,但是在添加質量濃度為0.12 g/L時,三萜產率顯著提高并達到最大值8.89 mg/g,較對照組提高了28.65%,且在添加質量濃度為0.20 g/L時顯著抑制三萜生成(圖2-b)。松油烯在試驗濃度范圍內也沒有對樟芝皿式培養生長產生明顯的促進作用,但對三萜產率有明顯的促進作用,三萜產率隨著添加濃度的增大而先升高后降低;松油烯添加質量濃度為0.16 g/L時,三萜產率達到最大值13.56 mg/g,較對照組提高了55.68%(圖2-c)。綜上所述,α-松油醇、4-萜烯醇和松油烯的最佳添加質量濃度分別為0.08、0.12、0.16 g/L。

a-α-松油醇;b-4-萜烯醇;c-松油烯

2.3 不同單萜對皿式培養樟芝三萜組成的影響

2.3.1 添加0.08 g/L α-松油醇對樟芝皿式培養三萜組成的影響

通過LC-MS對皿式培養基中添加0.08 g/L α-松油醇的菌絲體進行了檢測,液相圖譜顯示有4個峰(保留時間分別為3.86、6.07、6.27、6.74 min)的豐度比對照組顯著增加(圖3)。通過與文獻中樟芝三萜類物質質譜信息的對照,確定2號峰為三萜去氫硫色多孔菌酸,含量較對照組增加了3.20倍(表1)。

表1 培養基中添加0.08 g/L α-松油醇皿式培養樟芝菌絲體中三萜類物質的鑒定Table 1 Triterpenoids determination of the mycelia cultured with 0.08 g/L α-terpineol in petri-dish culture

a-添加0.08 g/L α-松油醇培養的菌絲體;b-對照組菌絲體

2.3.2 添加0.12 g/L 4-萜烯醇對樟芝皿式培養三萜組成的影響

通過LC-MS對皿式培養基中添加0.12 g/L 4-萜烯醇的菌絲體進行檢測,液相圖譜顯示有1個峰(保留時間:3.86 min)的豐度比對照組顯著增加(圖4)。與文獻中三萜類物質質譜信息進行比對,未能鑒定出此峰代表什么物質。

a-添加0.12 g/L 4-萜烯醇培養的菌絲體;b-對照組菌絲體

2.3.3 添加0.16 g/L 松油烯對樟芝皿式培養三萜組成的影響

通過LC-MS對皿式培養基中添加0.16 g/L松油烯的菌絲體進行了檢測,液相圖譜顯示有3個峰(保留時間分別為6.07、6.71、8.98 min)的豐度比對照組顯著增加(圖5)。通過與文獻中樟芝三萜類物質質譜信息的對照,確定1號峰為三萜去氫硫色多孔菌酸,含量較對照組增加了5.56倍;3號峰為三萜去氫齒孔菌酸,含量較對照組增加了0.96倍(表2)。

表2 培養基中添加0.16 g/L松油烯皿式培養菌絲體中三萜類物質的鑒定Table 2 Triterpenoids determination of the mycelia cultured with 0.16 g/L α-terpinene in petri-dish culture

a-添加0.16 g/L松油烯培養的菌絲體;b-對照組菌絲體

3 結論與討論

本文首先研究了3種單萜α-松油醇、4-萜烯醇和松油烯對樟芝皿式培養生物量和三萜產率的影響。結果表明,只有α-松油醇對樟芝生長具有促進作用,在α-松油醇添加質量濃度為0.08 g/L時,樟芝皿式培養生物量達到最大。且3種單萜對樟芝皿式培養三萜生成均有不同程度的促進作用,最佳添加濃度和作用大小為0.16 g/L松油稀>0.08 g/L α-松油醇>0.12 g/L 4-萜烯醇,三萜產率分別較對照組提高了55.68%、50.39%和28.65%。通過LC-MS對各組菌絲體三萜組成的分析,發現培養基中添加0.16 g/L松油烯的菌絲體中兩種三萜(去氫硫色多孔菌酸和去氫齒孔菌酸)的含量顯著升高,分別較對照組提高了5.56倍和0.96倍;培養基中添加0.08 g/L α-松油醇的菌絲體中去氫硫色多孔菌酸的含量顯著升高,較對照組提高了3.20倍。去氫硫色多孔菌酸和去氫齒孔菌酸都是樟芝的活性三萜,1996年這兩種三萜首次被YANG等[8]在樟芝子實體中檢測并鑒定出來;一些研究報道,去氫硫色多孔菌酸具有抗氧化活性[17],并且對人類白血病細胞系U397、胰腺癌細胞BxPC3[18]展現出了毒性作用;而去氫齒孔菌酸也被報道對多種癌細胞都具有毒性作用,包括膠質母細胞瘤細胞系U87MG[19]、結腸細胞系HT-29和HCT116、乳腺癌細胞系MDAMB231以及肺癌細胞系A549和CL1-0[20],另外,去氫齒孔菌酸也被報道在人體內具有抗炎癥作用[21]。由于去氫硫色多孔菌酸和去氫齒孔菌酸是野生樟芝子實體藥理活性的重要來源,因此提高人工培養樟芝菌絲體中這兩種三萜的產率具有重要的醫學價值。

羊毛甾烷型三萜的合成較麥角甾烷型三萜合成需要更少的步驟,因此羊毛甾烷型三萜能夠更快地響應萜類合成前體含量的變化。去氫硫色多孔菌酸和去氫齒孔菌酸是人工培養樟芝菌絲體中主要的羊毛甾烷型三萜,它們的產率一定程度上可以代表菌絲體內總三萜的表達水平[22],這個結論與本研究中的結果一致。在樟芝萜類合成的途徑中,單萜是三萜合成過程中的重要分支代謝產物,過多單萜的合成可能是人工培養樟芝三萜無法積累的原因。在本研究中,培養基中添加的3種單萜可能發揮了萜烯合酶抑制劑的作用,阻礙了萜類合成前體向單萜的轉化,從而使三萜的產率顯著提高。這也可能是在含有多種單萜及單萜衍生物的牛樟木上,野生樟芝子實體中三萜能夠大量積累的原因。在今后的研究中,期望通過實時熒光定量PCR檢測萜類合成相關基因的表達水平來證實這個假設。