玉米酒精的濃醪同步糖化發酵工藝研究

王祥余,李金龍,范文榜,阮明君,李麗,宗緒巖*,李陽源*

1(廣東溢多利生物科技股份有限公司,國家認定企業技術中心,廣東 珠海,519000)2(四川輕化工大學,釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)3(河南漢永酒精有限公司,河南 焦作,454750)

酒精是全球最大的生物發酵產品之一[1],據美國可再生能源燃料協會(Renewable Fuels Association,RFA)統計2020年全球酒精產量前四的美國、巴西、歐盟和中國分別為138.0、79.3、12.5和8.8億加侖[2]。中國酒業協會酒精分會統計數據也表明2021年全國酒精總產量為946萬t,其中玉米酒精占比約65%,與美國一樣玉米是主要原料[1,3]。

近年來,隨著糧食價格上漲[3-4]、酒精價格走低[3]和國家補貼減少[5],酒精企業普遍出現虧損現象[3,6],所以不少酒精企業已積極開展降本增效的研究:在原料方面,研究者們[7-9]嘗試采用不同原料進行酒精發酵,發現高粱、大麥、水稻等也可使用,這為降低原料成本做了有益探索。在發酵技術方面,BAO等[10]使用濃醪木薯酒精發酵取得成功,既節約能源也有助于減少污水排放;ZHANG等[11]用同步糖化發酵法提高甘薯生產酒精效率取得成功;武國慶等[12]則在超存稻谷燃料乙醇生產中使用半連續發酵,成功提高了陳化稻谷生產酒精效率;唐丹等[13]總結了酒精發酵的無蒸煮工藝,這對降低酒精生產能耗有一定參考意義。在酵母培養方面,LI等[14]研究了高濃酒精發酵條件下氮源問題,為優化酵母培養提供了經驗支持;DLAMINI等[15]發現至少需要150 mg/L游離氨基氮才能滿足正常的發酵過程,為使用酸性蛋白酶及酵母促進劑提供了控制標準;BAI等[16]闡述了酵母對各種條件的耐受性,為優化酵母培養條件提供指導。在酶制劑應用方面,技術人員已發現酸性蛋白酶在酒精發酵過程中不俗的表現[17-18],也闡述了諾維信低pH淀粉酶和復配糖化酶的設計原理和應用效果[19],這些都為節約化學品和擴大酒精生產原料提供新的酶制劑解決方案。

論文基于目前的玉米酒精實際生產工藝,系統考察原料濃度、液化工藝、和發酵工藝等技術參數嘗試模擬實際生產研究,以期為生產線調整提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉,山東省夏津縣富民小米生產農民專業合作社,其中玉米粉的水分含量為(12.48±0.08)%,淀粉含量(酶法)為(74.42±0.76)%[20]。

耐高溫α-淀粉酶(196 771 U/mL)、葡萄糖淀粉酶(364 293 U/mL),溢多利生物科技股份有限公司;發利釀酒高活性干酵母(Fali Yeast耐高溫型),益海嘉里英聯馬利投資有限公司。

1.2 材料與試劑

MB-800自動糖化儀,廣東嘉儀儀器集團有限公司;NDJ-5S黏度計,上海平軒科學儀器有限公司;GC-2010 Plus氣相色譜,日本島津公司;J&W DB-WAX UI超高惰性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技(中國)有限公司;MB23水分分析儀,豪奧斯(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米酒精發酵的液化工藝

玉米酒精發酵工藝及其過程參數的檢測方法參見文獻[20]。

1.3.1.1 拌料DS的選擇

分別將玉米漿的拌料DS設定為25%、28%和31%,考察在液化pH 5.6、液化溫度88 ℃、液化時間120 min、耐高溫α-淀粉酶劑量40 U/g原料、葡萄糖淀粉酶150 U/g原料、發酵溫度32 ℃、酵母接種量3%條件下的酒精發酵完成時間和CO2失重。

1.3.1.2 液化條件的選擇

在確定拌料DS 25%前提下,分別優化液化pH(4.8、5.2、5.6)、液化時間(60、120、180 min)、耐高溫α-淀粉酶劑量(30、40、50 U/g原料)、液化溫度(84、88、92 ℃),考察指標為液化還原糖。

1.3.2 玉米酒精的同步糖化發酵工藝

在確定拌料DS 25%、液化pH 5.6、液化時間120 min、耐高溫α-淀粉酶劑量40 U/g原料、液化溫度88 ℃條件下,優化葡萄糖淀粉酶劑量(100、150、200 U/g原料)、發酵溫度(30、32、34 ℃)和酵母接種量(3%、9%、15%),考察指標為酒精發酵完成時間和CO2失重。

1.3.3 玉米酒精發酵的性能分析

1.3.3.1 液化指標分析

在拌料DS 25%、液化pH 5.6、液化時間120 min、耐高溫α-淀粉酶劑量40 U/g原料、液化溫度88 ℃進行液化試驗,考察指標為液化還原糖、液化碘試、液化醪黏度。

1.3.3.2 發酵過程分析

在拌料DS 25%、液化pH 5.6、液化時間120 min、耐高溫α-淀粉酶劑量40 U/g原料、液化溫度88 ℃、葡萄糖淀粉酶劑量150 U/g、酵母接種量3%和發酵溫度32 ℃條件下進行發酵試驗,考察指標為發酵CO2失重。

1.3.3.3 發酵指標分析

將1.3.3.2節中所得的發酵成熟醪進行分析,考察指標為乙醇、殘總糖、殘淀粉、殘過濾總糖、殘糊精、殘淀粉和殘還原糖。

1.3.4 數據處理

每個實驗重復3次,每次樣品檢測2次。采用Excel 2013和Graph Pad Prism 8.0對數據進行處理、繪圖和顯著性分析,P>0.05差異不顯著,P<0.05差異顯著,P<0.01差異極為顯著,數據以(平均值±標準差)的形式表示(n=6或者3)。

2 結果與分析

2.1 玉米酒精發酵的液化工藝

2.1.1 拌料DS的選擇

目前我國玉米酒精生產過程中拌料DS范圍是25%～31%,但實驗室規模發酵不同于大生產,無法做到多級酵母擴培和大規模接種,因此在保證發酵完成時間和發酵指標的前提下實驗室玉米酒精發酵方法所能接受的拌料DS濃度是有限的。如圖1所示在DS 25%、DS 28%和DS 31%情況下,玉米酒精發酵結束時間(以24 h CO2失重<0.10 g為發酵結束)分別是136、168和216 h,同時發酵成熟醪殘總糖分別是(13.78±0.22)、(16.39±0.65)和(19.26±0.27) g/L。結果表明選擇拌料DS 25%既可最大幅減少酒精發酵時間,同時得到最低的發酵成熟醪殘總糖(P<0.001),取得最好的發酵指標。

a-CO2失重;b-成熟醪殘總糖

2.1.2 液化條件的選擇

在同步糖化發酵玉米酒精的實際生產過程中液化還原糖的控制范圍為8～12 g/100 g,以滿足發酵的初始糖濃度要求,同時避免較高的滲透壓影響酵母的生長繁殖和酒精發酵活動[7,11,21]。

如圖2-a所示在液化pH值為4.8～5.6范圍內隨著液化pH的升高耐高溫α-淀粉酶液化效果得到迅速提升,其中在pH 4.8條件下液化還原糖僅為(5.27±0.04) g/100 g,不能滿足生產工藝需求;pH 5.2時液化還原糖較pH 5.6時的顯著偏低(P<0.01),因此選擇液化pH 5.6。

a-pH值;b-液化時間;c-淀粉酶劑量;d-液化溫度

如圖2-b所示在液化時長為60～180 min范圍內隨著液化時間的延長液化還原糖先迅速升高,后趨于平衡,其中液化120 min和液化180 min液化還原糖無顯著差異(P>0.05),因此選擇液化120 min。

如圖2-c所示在淀粉酶(耐高溫α-淀粉酶)劑量為30～50 U/g范圍內隨著淀粉酶劑量的提高液化還原糖先迅速升高,后趨于平衡,其中液化40和50 U/g液化還原糖無顯著差距(P>0.05),因此選擇40 U/g。

如圖2-d所示在液化溫度為84～92 ℃范圍內隨著液化溫度的提高液化還原糖先迅速升高,后逐步下降,其中液化溫度為88 ℃時液化還原糖比液化溫度84和92 ℃提高幅度極為顯著(P<0.001),因此選擇液化溫度為88 ℃。

綜上,液化工段的最佳條件為液化pH 5.6、液化時間120 min、淀粉酶使用劑量40 U/g和液化溫度88 ℃。

2.2 玉米酒精的同步糖化發酵工藝

2.2.1 葡萄糖淀粉酶制劑用量

目前國內玉米酒精企業使用葡萄糖淀粉酶劑量的范圍大致在100～200 U/g,企業的主流使用劑量為150 U/g左右,因此優化實驗采用100、150、200 U/g 3個水平來考察。實驗結果如圖3-a所示,以24 h CO2失重低于0.10 g為酒精發酵終點,發酵終點時間和CO2總失重分別為100 U/g[168 h、(15.74±0.13) g]、150 U/g[136 h、(15.78±0.10) g]和200 U/g[112 h、(15.69±0.05) g]。其中葡萄糖淀粉酶劑量100 U/g的成熟醪殘總糖和劑量150 U/g的及劑量200 U/g的均有著明顯差異(P<0.01),葡萄糖淀粉酶劑量150 U/g的成熟醪殘總糖和劑量200 U/g的則差異不顯著(P>0.05)。因此選擇葡萄糖淀粉酶劑量為150 U/g既可有效地控制發酵時間,也可取得更高的糧酒轉化率[22]。

a-CO2失重;b-成熟醪殘總糖

2.2.2 發酵溫度

目前國內玉米酒精企業發酵溫度在30～36 ℃,其中34 ℃以上的發酵溫度已被證明不利于酵母的生長繁殖和酒精生產,因此優化實驗采用30、32、34 ℃ 3個水平來考察。實驗結果如圖4-a所示以24 h CO2失重<0.10 g為酒精發酵終點,發酵終點時間和CO2總失重分別為30 ℃[136 h、(15.78±0.05) g]、32 ℃[112 h、(15.71±0.07) g]和34 ℃[96 h、(15.49±0.15) g],在發酵速度方面有著明顯差異(P<0.01)。如圖4-b所示,繼續發酵至216 h發酵溫度為34 ℃的CO2失重顯著低于32、30 ℃(P<0.01),而32、30 ℃條件下的CO2失重差異表現不明顯(P>0.05),綜上選擇發酵溫度32 ℃既可節約冷卻用水同時可滿足生產需求。

2.2.3 酵母接種量

目前國內玉米酒精生產工藝中的酵母接種量范圍為15%～55%,其中較高酵母接種量可減少發酵時間、降低染菌風險。但在實驗規模條件下進行大規模酒母種子培養是困難的,因此選擇在有限的范圍內(3%、9%和15%)考察接種量對酒精發酵的影響。實驗結果如圖5-a所示,以24 h CO2失重低于0.10 g為酒精發酵終點,發酵終點時間和CO2總失重分別為3%酵母接種量[112 h、(15.71±0.07) g]、9%酵母接種量[96 h、(15.90±0.06) g]和15%酵母接種量[88 h、(15.89±0.13) g],在發酵速度方面3%酵母接種量和9%酵母接種量及15%酵母接種量有著明顯差異(P<0.01),而9%酵母接種量和15%酵母接種量之間則差異不顯著(P>0.05)。如圖5-b所示繼續發酵至216 h,3%酵母接種量、9%酵母接種量和15%酵母接種量的CO2失重不顯著(P>0.05)。盡管酵母接種量3%發酵速度稍慢但也可順利完成發酵,為了便利選擇3%酵母接種量較為合適。

a-CO2失重;b-發酵216 h CO2失重

2.3 玉米酒精發酵的性能分析

2.3.1 工藝優化后的液化指標分析

如表1所示,使用實驗室玉米酒精發酵方法條件下液化還原糖、碘試顏色和液化醪黏度均符合工藝指標需求[1]。同時上述3個指標的標準差分別僅為0.03、0.005和2.8,標準差占其相應的平均值分別僅為0.25%、3.03%和4.02%,結果表明該方法截止液化完成數據波動很小,液化表現十分穩定,可信度較高。

表1 液化工段指標分析Table 1 Analysis of liquefaction process indexes

2.3.2 工藝優化后的發酵過程分析

如圖6所示CO2失重在發酵64 h之后趨于緩和,如果以24 h CO2失重<0.10 g醪液為酒精發酵終點則發酵應該在136 h結束(15.03±0.07) g。在酒精發酵過程中CO2失重標準差最大值出現在發酵48 h,為0.38,占相應CO2平均失重為2.96%;在整個發酵過程中發酵16 h的標準差為0.28,其占相應CO2平均失重為4.67%,是酒精發酵過程中的最大值。發酵過程中較低的標準差表明該玉米酒精發酵方法在發酵過程中表現非常穩定。

圖6 玉米SSF酒精方法發酵過程表現Fig.6 Performance of fermentation based on corn SSF ethanol production method

2.3.3 發酵指標分析

在實驗中每個發酵瓶使用150.60 g的拌料為DS 25%玉米漿(包括接種酵母引入的約0.6 g玉米漿),根據玉米粉的含水量可得每個發酵瓶的玉米粉使用量C=43.02 g;根據玉米粉淀粉含量可得每個發酵瓶中淀粉含量為S=32.01 g;根據發酵144 h的CO2失重,每個發酵瓶發酵體系重量(153 g)和發酵成熟醪密度(0.978 0±0.000 1) g/mL可計算得到發酵成熟醪體積為V=141.03 mL;如表2所示,發酵成熟醪酒精含量為(12.58±0.04) g/100 mL,計算可得發酵酒精質量為A=17.74 g。因此淀粉酒精轉化率=A/S=0.554 2 t/t;糧食酒精轉化率(糧酒轉化率)=C/A=2.425 t/t。每克淀粉理論上可以產生酒精0.567 21 g[14]。定義發酵效率=實際淀粉酒精生產率/理論酒精生產率,則發酵效率=淀粉酒精轉化率/理論酒精生產率×100%=97.71%,證明該玉米酒精發酵方法可高效利用淀粉。

表2 發酵成熟醪主要指標分析Table 2 Analysis of main indexes mature fermented mash

目前國內玉米酒精的糧酒轉化率范圍是2.900～3.100 t/t[7],而實驗的糧酒轉化率卻遠低于這個范圍,其原因是實驗使用的玉米粉原料淀粉含量高、雜質少所致,與2.1節的分析結果相一致;假設郭孝孝等[4]所使用的玉米粉含水量和本實驗使用的玉米粉含水量一致,則糧酒轉化率可折合為:2.425 t/t×(74.42%/59.1)=3.053 t/t,正好處于國內玉米酒精的糧食酒精轉化率范圍之內,證明該玉米酒精發酵方法可以模擬玉米酒精的實際生產情況;同時考慮到成熟醪酒份的標準差為0.04,僅為其對應成熟醪酒份的0.31%,證明該方法表現極為穩定。

表2中發酵成熟醪殘總糖和殘淀粉均在國內酒精行業實際生產的正常范圍之內,一方面表明該方法在成熟醪殘總糖和殘淀粉2個重要指標方面結果真實可靠,另一方面較低的數據標準差也表明該玉米酒精發酵方法極為穩定。同樣的,表2中成熟醪殘過濾總糖、殘糊精、殘還原糖方面標準差均比較小,進一步證明該方法表現穩定。同時分析上述數據可知,發酵成熟醪中殘過濾總糖、殘糊精表現稍高的主要原因是殘還原糖較高,國內發酵指標優異企業發酵成熟醪殘還原糖在0.20～0.25 g/100 g范圍內,表明酵母接種量和酵母質量仍需要提高,大規模酵母接種是有意義的[1]。除去成熟醪中表現較高的殘還原糖的部分,則殘過濾總糖和殘糊精表現正常,表明本玉米酒精發酵方法使用的溢多利耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶也有較為優秀的表現。

此外,較高的發酵濃度可以降低酒精生產成本,但也因其較高的醪液滲透壓抑制發酵初期酵母的繁殖和生長、降低了發酵速率、導致發酵成熟醪殘還原糖升高,產生更多的甘油[23]、海藻糖[24]等代謝產物,增加糧耗[7, 14, 21]。解決問題的方法有減少耐高溫α-淀粉酶使用劑量[20]、提高葡萄糖淀粉酶使用劑量、優化發酵過程中可發酵糖的供給情況、補充有機氮源或者無機氮源[15, 18]、提高酵母接種量、使用耐高酒精和耐高滲透壓的新型酵母等。上述調整均可使用本實方法進行探索以實現酒精的高濃發酵,做到降本增效,提高酒精企業的收益。

3 結論

1)在拌料DS 25%、液化pH 5.6、液化時間120 min、耐高溫α-淀粉酶劑量40 U/g、液化溫度88 ℃、葡萄糖淀粉酶劑量150 U/g、發酵溫度32 ℃和酵母接種量3%條件下構建的實驗室規模玉米酒精發酵方法穩定性良好,實驗數據符合我國玉米酒精生產企業的實際情況,可為玉米酒精發酵工藝的調整和輔料的篩選提供較為準確的數據參考。

2)采用淀粉含量高的原料、合理的拌料濃度、優質的耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶并設定最適的液化工藝參數[20]和發酵工藝參數均有利于降低噸酒糧耗,提高糧酒轉化率。