酶解鮑魚肽特性及其抗氧化與調節免疫的研究

江新輝,江敏,謝永燦,張國強,藍登杭,劉海霞,溫海蘭,江銘福,*

1(福建大眾健康生物科技有限公司,福建 福州,350500)2(福州日興水產食品有限公司,福建 福州,350500)3(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)

鮑魚是一種海洋腹足類動物,單殼軟體動物,深受廣大消費者的喜愛。鮑魚作為重要海洋產品,其市場價格低于高檔名貴經濟魚類,但它們的營養價值并不遜色,具有很高的食用價值和藥用價值[1]。本草綱目記載,鮑魚性平,味甘,咸,可明目補虛、清熱滋陰、養血益胃、補肝腎[2]。鮑魚富含蛋白質、多糖、?；撬峒拔⒘吭豙3-4],而它的肽制品中膠原蛋白含量也高達30%～50%,遠高于其他魚貝類,同時,鮑魚中的?；撬?、硒等的含量遠高于貽貝、牡蠣、文蛤等常見海洋貝類,是開發海洋生物活性肽的良好資源[5]。研究者們[6-7]發現鮑魚酶解產物具有較好的體外抗氧化性能;QIAN等[8]研究了鮑魚副產物對高血壓大鼠血管緊張素的抑制作用和降血壓作用,王軍玲[9]提取了鮑魚不同部位的多糖,發現其具有抗腫瘤和調節免疫活性的功能,目前也有多篇文獻研究了鮑魚肽的制備[10-12],但對鮑魚肽的體內抗氧化、提高免疫的功能評價研究較少。

本論文研究了酶解鮑魚肽的分子質量分布,并對氨基酸含量進行測定,結合動物實驗的抗氧化酶活性、血液白細胞數、細胞免疫、體液免疫和NK細胞活性等指標,評估了鮑魚肽的體內抗氧化和提高免疫力的功能性,旨在為鮑魚肽的深入應用提供更多理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

本研究所使用鮑魚肽由福建大眾健康生物科技有限公司提供,制備過程經過鮑魚肉蒸煮預處理,降溫后添加固含量2%復合蛋白酶(含木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶等)水解5 h,后期分離干燥獲得固體粉末,密封于鋁箔袋中4 ℃避光干燥保存。

丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(reducing glutathione,GSH)測試盒、BCA法蛋白定量測試盒、蛋白質羰基(protein carbonyl,PCO)含量測試盒,南京森貝伽生物科技有限公司;RPMI1640完全培養液、小牛血清、PBS、青鏈霉素,賽默飛世爾科技公司;小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1),中國科學院細胞庫;綿羊紅細胞(SRBC)、Hank’s液(pH=7.2)、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑藍 (MTT)、補體(豚鼠血清)、SA緩沖液、都氏試劑、生理鹽水、LDH基質液、氧化型輔酶I等,上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純,美國TEDIA公司;四氫呋喃、三乙胺、鹽酸、結晶乙酸鈉、三氟乙酸均為分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;1 nmol/μL 的17種氨基酸標準品(天門冬氨酸、組氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸)、細胞色素C(Mw=12 384 Da)、抑肽酶(Mw=6 500 Da)、桿菌肽(Mw=1 422 Da)、乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸(Mw=451 Da)、乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸(Mw=189 Da),Sigma公司;鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、芴甲氧羰酰氯(fluorene methoxycarbonyl chloride,FMOC),美國安捷倫公司。

BS420全自動生化分析儀,邁瑞醫療器械公司;ChampSpot Ⅲ溶血空斑檢測儀,北京安泰永信醫療公司;1510全波長酶標儀、TSK gel 2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm)、Countess Ⅱ全自動細胞計數儀,美國賽默飛世爾科技公司;Agilent1100高效液相色譜系統、Agilent Hypersil ODS柱(5 μm,4.0 mm×250 mm),美國安捷倫公司。

1.2 實驗動物

SPF級健康雄性KM小鼠(18～22 g),由斯貝福(蘇州)生物技術有限公司提供(許可證號為SCXK(京)2022-0006),動物質量合格證編號:2022248509。

1.3 實驗方法

1.3.1 鮑魚肽的分子質量分布分析

采用高效液相色譜儀檢測鮑魚肽的相對分子質量分布,色譜條件:色譜柱TSK gel 2000 SWXL,流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=36∶64∶0.1,檢測波長UV 205 nm,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,上樣體積10 μL。樣品制備:配制10 g/L鮑魚肽溶液,微孔濾膜(13 mm×0.45 μm)過濾后進樣。以細胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸為標準品,測定鮑魚肽中肽段的分布情況。

1.3.2 氨基酸組成測定

樣品制備:酸水解過程(色氨酸被破壞):準確稱取0.1 g鮑魚肽放入水解管,加入8 mL 6 mol/L HCl。充氮氣3 min,擰緊水解管,置于120 ℃烘箱中,水解22 h,加入4.8 mL 10 mol/L NaOH中和,用蒸餾水定容至25 mL,雙層濾紙過濾,取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內,15 000 r/min,30 min。上樣檢測。堿水解過程(測色氨酸,其他氨基酸部分被破壞):準確稱取0.1 g鮑魚肽放入水解管,加入8 mL 5 mol/L NaOH。充N23 min,擰緊水解管,置于120 ℃烘箱中,水解22 h,加入6.7 mL 6 mol/L HCl中和,用蒸餾水定容至25 mL,雙層濾紙過濾,取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內,15 000 r/min,30 min。上樣檢測。

采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜紫外檢測法測定總氨基酸(total amino acid,TAA),流動相A(pH=7.2):V(27.6 mmol/L醋酸鈉)∶V(三乙胺)∶V(四氫呋喃)=500∶0.11∶2.5。流動相B(pH=7.2):V(80.9 mmol/L醋酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2。Agilent Hypersil ODS柱;采用梯度洗脫,洗脫程序為:0 min, 8% B;17 min, 50% B;20 min, 100% B;24 min, 0% B;流速為1.0 mL/min;柱溫40 ℃;紫外檢測器檢測波長為338 nm,脯氨酸以262 nm檢測;氨基酸含量以外標法定量。

1.3.3 抗氧化功能評價

購入SPF級健康雄性KM小鼠,按體重隨機分成5個組,即空白組、模型組、低(0.25 g/kg BW)、中(0.5 g/kg BW)、高(1.0 g/kg BW)3個劑量組,每組10只動物。適應5 d后,受試樣品組經口灌胃連續給予30 d,灌胃量為10 mL/kg BW,空白和模型組灌胃等量蒸餾水。末次灌胃后,除空白組外,其余4組禁食16 h(過夜)后一次性灌胃給予50%(體積分數)乙醇12 mL/kg BW進行造模,6 h后取肝臟,液氮速凍后放入-80 ℃冰箱存放備用。用試劑盒法測定小鼠血清中脂質氧化產物MDA、PCO、GSH含量、抗氧化酶SOD活力。具體方法參照食藥監?；痆2012]107號附件1抗氧化功能評價方法進行。

1.3.4 提高免疫功能評價

按照1.3.3節分組及處理進行實驗。分別進行血液白細胞數測定試驗、ConA誘導小鼠淋巴細胞轉化試驗(MTT法)、遲發型變態反應試驗(足趾增厚法)、抗體生成細胞試驗 (Jerne改良玻片法)、血清溶血素測定試驗 (半數溶血素法)和NK活性測定試驗(乳酸脫氫酶測定法)。具體方法參照《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版,征求意見稿)》中的免疫功能低下模型方法。

1.3.5 數據處理

試驗數據結果用SPSS軟件進行方差齊性檢驗,數據采用平均值±標準差表示,P<0.05表示具有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 鮑魚肽分子質量分布與氨基酸含量分析

圖1中可以看出,鮑魚肽分子質量在450 Da以下的肽約占40%,表明鮑魚肽主要是由2～3個氨基酸殘基組成的小肽。寡肽尤其是二肽、三肽極易穿越小腸黏膜被機體吸收用[13],且容易作為機體的能量來源,緩解疲勞,具有較高的營養價值[6-7]。GUO等[14]研究發現,通過優化酶解條件對鮑魚內臟進行酶解,篩選得到的分子質量在1 500～6 000 Da鮑魚肽,可以清除DPPH自由基和羥自由基,具有較高的體外抗氧化性。

圖1 鮑魚肽分子質量分布Fig.1 Molecular weight distribution of abalone peptide

由表1可知,鮑魚肽的氨基酸總量為72.54 g/100 g,其中谷氨酸含量最高,其次是天冬氨酸和精氨酸。必需氨基酸含量為23.34 g/100 g,占鮑魚肽氨基酸總量的39.94%。喬路[15]在試驗中發現,鮑魚內臟酶解產物中的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量較高,且特定的氨基酸殘基和多肽水解產物的抗氧化活性有著很好的相關性,國內外研究者也紛紛證明,高含量氨基酸普遍具有抗氧化活性[16]。試驗選用小鼠進一步驗證和評價鮑魚肽的體內抗氧化性。

表1 鮑魚肽氨基酸成分分析Table 1 Analysis of amino acid composition of abalone peptide

2.2 鮑魚肽對小鼠血清中抗氧化指標的影響

MDA是機體內脂質過氧化作用分解所產生的,其濃度與細胞膜受損程度呈正相關[17];機體內氧化劑含量升高會加速蛋白質羰基化,使細胞遭受自由基的破壞,體內PCO含量越高,表明機體抗氧化能力越弱[18-19]。GSH和SOD可以清除體內H2O2和脂質過氧化物,具有抗氧化作用,機體可以通過提高這類抗氧化物酶活力來強化機體清除自由基的能力[20-21]。

由表2可知,小鼠連續灌胃30 d后,與空白組比較,模型組小鼠肝臟GSH和SOD含量均顯著低于空白組(P<0.01),MDA和PCO含量均顯著高于空白組(P<0.01),表明急性酒精肝損傷動物模型造模成功。鮑魚肽3個劑量組的MDA和PCO含量與模型組相比均顯著降低(P<0.01),SOD含量與模型組相比顯著升高(P<0.01),中、高劑量組小鼠的GSH含量與模型組相比顯著升高(P<0.01),表明鮑魚肽可以迅速提高肝損傷小鼠體內SOD和GSH含量,抑制MDA和PCO的產生,減輕肝臟內氧化應激反應,提高肝細胞的抗氧化能力,從而發揮保護作用。

表2 小鼠血清中MDA、PCO、GSH和SOD含量Table 2 MDA, PCO, GSH, and SOD content in serum of mice

2.3 鮑魚肽對免疫低下模型小鼠提高免疫的功能評價

2.3.1 鮑魚肽對小鼠血液白細胞數的影響

白細胞是機體免疫系統和防御系統的重要組成部分,圖2可以看出模型組白細胞數顯著低于空白組,說明免疫低下模型造模成功。與模型組相比,中、高劑量組的白細胞數均有顯著性的上升,且有一定的量效關系。說明鮑魚肽可以提高免疫低下小鼠的白細胞數量。

圖2 鮑魚肽對小鼠血液白細胞的影響Fig.2 Effect of abalone peptide on leukocyte in mouse blood

2.3.2 鮑魚肽對小鼠細胞免疫功能的影響

淋巴細胞轉化能力和遲發型變態反應可反映機體細胞免疫功能,淋巴細胞轉化能力是細胞免疫能力最直接的指標,脾臟內的T淋巴細胞和B淋巴細胞受到抗原刺激會產生淋巴因子或抗體,誘導機體發生免疫應答[22]。遲發型變態反應是當機體被致敏性T細胞刺激時產生的一種細胞免疫反應,足趾腫脹度越高,機體免疫功能越強。由圖3可知,與空白組相比,模型組小鼠脾淋巴細胞增殖能力與足趾腫脹有顯著性變化,說明免疫低下模型造模成功,3個劑量組的淋巴細胞轉化能力與模型組相比,無顯著變化;低劑量組的足趾腫脹度顯著高于模型,中、高劑量組的組織腫脹度與模型組相比,無顯著差異。從淋巴細胞增殖能力和足趾腫脹度兩個試驗看出,鮑魚肽未能提高T細胞的應答能力增強小鼠的細胞免疫功能。

a-淋巴細胞增殖能力;b-足趾腫脹度

2.3.3 鮑魚肽對小鼠體液免疫功能的影響

血清溶血素水平反映淋巴細胞的增殖和分化水平,溶血素高低與抗體形成細胞數量成正比,從而評價機體體液免疫功能[23];溶血空斑數量也可反映抗體生成細胞能力。圖4可以看出,模型組的半數溶血值和溶血空斑數顯著低于空白組,說明環磷酰胺造免疫低下模型成功,3個劑量組與模型組相比,均有量效關系的上升,高劑量組的半數溶血值和溶血空斑數量與模型組相比,均有顯著性差異。從這兩個試驗看,鮑魚肽在一定程度上可以調節體液免疫功能。

a-血清溶血素含量;b-抗體生成細胞含量

2.3.4 鮑魚肽對小鼠NK細胞活性的影響

NK細胞是機體重要的免疫細胞,與抗腫瘤、抗病毒和調節免疫有關,是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標。由表3可知,模型組的NK細胞活性顯著低于空白組,說明免疫低下模型造模成功。中、高劑量組的NK細胞活性均有顯著性的回升,表明鮑魚肽具有增強小鼠NK細胞活性的作用。

表3 鮑魚肽對小鼠NK細胞活性的影響Table 3 Effect of abalone peptide on the activity of mouse NK cells

3 結論

鮑魚肽的分子質量95%分布在6 500 Da以下,易于吸收,在機體中更易發揮其活性。通過動物實驗,發現鮑魚肽可以提高急性酒精肝損傷動物的抗氧化物酶含量,降低機體內的MDA和PCO含量,從而發揮輔助抗氧化能力;鮑魚肽還可以提高免疫低下模型小鼠的白細胞數量,調節小鼠體液免疫功能和NK細胞活性,從而增強免疫低下小鼠的免疫力。本研究結果為未來功能性鮑魚肽的研究與開發提供參考。