基于干酪乳桿菌ZLC01的山羊奶發酵乳及其特征性代謝物研究

王道滇,肖夢林,魏光強,黃艾祥,和萬忠,施婭楠*

1(云南農業大學 食品科學技術學院,云南 昆明,650201)2(云南皇氏來思爾乳業有限公司,云南 大理,671000)3(迪慶藏族自治州生產力促進中心,云南 迪慶藏族自治州,674499)

山羊乳是一種獨特的乳資源,是我國豐富乳品消費結構、助力產業扶貧的重要產業[1]。山羊乳富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質,有“奶中之王”的美稱[2-3]。與牛奶相比,山羊乳富含容易消化分解的A2型β-酪蛋白[4],脂肪球粒徑小[5];此外,羊乳功能性不飽和脂肪酸的含量與人乳相近[6],致敏性低、易消化吸收,是潛在的人乳替代品[7]。然而,較小的脂肪球,較多的短、中鏈脂肪酸,尤其是C6～C10的游離脂肪酸[8]和較低含量的酪蛋白造成羊奶膻味重、發酵乳組織狀態差。因此,山羊奶發酵乳風味和品質的改善有待解決。

具備較好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌能夠代謝產生氨基酸、脂肪酸等代謝物,加速凝乳,改善乳制品的風味和質地[9-10]。益生菌復配發酵能對羊奶的營養價值、風味和組織狀態產生積極貢獻[11];嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌是乳制品中常用的傳統發酵劑,能在一定程度上掩蓋羊奶的膻味[12-13],但其對羊奶凝乳能力較差。羅伊氏乳桿菌凝乳能力好,可用于發酵乳餅的研制[14];干酪乳桿菌產酸和蛋白水解能力強,可產生胞外多糖增強發酵乳的黏附性,提高酸奶結構的穩定性[15];干酪乳桿菌與短乳乳桿菌CGMCC1.5954復配發酵可提高益生菌活菌數、增強乳凝膠硬度,減少乳清析出[16];PENG等[17]添加干酪乳桿菌和雙歧桿菌V9發酵牛奶,提高了發酵乳的活菌數和短鏈脂肪酸含量,賦予發酵乳更佳的口感和風味。

羊奶發酵乳具有輔助調節血脂、降低膽固醇、改善炎癥等生物學價值[18]。目前,云南市售的山羊奶發酵乳膻味較重,組織狀態較差,所含物質不明確,品質有待提升,山羊奶品質改善及新產品的開發具有良好的發展前景;研究旨在篩選具有較好蛋白和脂肪降解能力的發酵劑制備新型山羊奶發酵乳(new fermented goat milk,LBSTL-GMFM),解決傳統發酵劑加工山羊奶發酵乳(fermented goat milk,LBST-GMFM)品質較差的問題,基于代謝組學技術探究山羊奶發酵乳的關鍵代謝物及相關代謝通路,為山羊奶發酵乳的研究與開發提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山羊奶(蛋白質2.99 g/100 g,脂肪3.34 g/100 g,乳固形物11.73 g/100 g),云南石林小尖山乳制品廠。

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)21728菌株和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricussubsp.)6098菌株,中國工業微生物菌種保藏管理中心;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)ZLC01、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)由生產乳餅、乳扇的酸乳清中分離鑒定。

酚酞(分析純),天津市北辰方正試劑廠;氨水(色譜純),費希爾化學公司;乙酸銨、乙腈和甲醇均為色譜純,德國默克股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HPX-9272ME培養箱,上海博訊實業有限公司;GJJ-0.06/70高壓均質機,上海諾尼輕工機械有限公司;Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨質譜、Heraeus Fresco17離心機,賽默飛世爾科技公司;Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱,Waters有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山羊奶發酵乳加工工藝設計

山羊奶發酵乳加工工藝如圖1所示。

圖1 山羊奶發酵乳加工工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of fermented goat milk

1.3.2 發酵劑的篩選

乳酸菌的蛋白水解度和脂肪降解能力越強,發酵乳風味和凝乳效果越好。將保加利亞乳桿菌亞種、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌ZLC01、羅伊氏乳桿菌、副干酪乳桿菌這5株菌活化至活菌數108CFU/g,按表1組合復配(體積比)發酵山羊奶,篩選具有較好蛋白質和脂肪降解能力的乳酸菌作為實驗菌種;蛋白水解度參照羅艷華等[19]的方法測定;游離脂肪酸含量參照蘇偉麗[20]的方法測定。

表1 發酵劑菌種組合列表Table 1 List of strains combination for directed vat set

1.3.3 發酵乳感官評價

由10位感官評估人員對產品色澤、氣味、滋味、組織狀態進行感官評定,評分標準見表2。

表2 感官評定標準Table 2 Sensory assessment criteria

1.3.4 理化指標和乳酸菌數測定

酸度參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》測定;黏度用黏度計(3號轉子,轉速30 r/min,時間30 s)測定;持水力參照GUO等[21]的方法測定;乳酸菌數參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》法測定。

1.3.5 發酵乳代謝物檢測

樣品前處理:取100 μL樣品于400 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1,含同位素標記內標混合物]中,渦旋混勻30 s,超聲10 min(冰水浴),-40 ℃靜置1 h,離心后取上清液于進樣瓶中上機檢測。

UPLC條件:使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱,A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。樣品盤溫度4 ℃,進樣體積3 μL。

質譜條件:選擇QE HFX質譜儀,采用電噴霧電離源(electron spray ionization,ESI)采集數據。正離子模式下噴霧電壓為3 600 kV;負離子模式下噴霧電壓為-3 200 kV。鞘氣體流量30 Arb;輔助氣體流量25 Arb;毛細管溫度350 ℃;全MS分辨率為60 000,MS/MS分辨率為7 500;NCE模式碰撞能量為10/30/60 eV。原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后,使用自主編寫的R程序包(內核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋,算法打分的Cutoff值設為0.3。

1.3.6 數據統計分析

所有試驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。采用Microsoft Excel 2007、SPSS 19.0進行數據處理,Origin 2018進行圖表繪制;使用R軟件對代謝物進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)?；贠PLS-DA,根據變量投影重要度(variable importance in project,VIP)>1.5,t檢驗的P<0.05和|log2FC|>1(FC為差異倍數,fold change)進行差異代謝物篩選,將差異代謝物通過代謝通路數據庫KEGG Pathways(KEGG,www.genome.jp/kegg)進行注釋解析。

2 結果與分析

2.1 發酵劑的篩選

具有較好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌可加速凝乳,改善發酵乳的風味和質地[9]。如圖2所示,相比于其他發酵劑,發酵劑B的蛋白水解度和游離脂肪酸含量分別為(9.29±0.24)%、(9.67±0.18) μmol/mL。較小的脂肪球、高含量的中鏈脂肪酸是山羊奶組織狀態差、膻味重的原因[8],高含量的游離氨基酸和脂肪酸有助于提高發酵乳的風味和口感[10];發酵劑B的蛋白水解度和游離脂肪酸含量較高,說明發酵劑B有較好的凝乳和產香能力。據報道,干酪乳桿菌具有較好的脂肪和蛋白水解能力[22],可與其他菌種復配發酵,賦予產品更佳的風味品質[23]。綜上,選擇發酵劑B[V(保加利亞乳桿菌)∶V(嗜熱鏈球菌)∶V(干酪乳桿菌ZLC01)=1∶1∶3]作為后期實驗發酵劑。

圖2 發酵劑篩選Fig.2 Fermentation starter screening

2.2 山羊奶發酵乳品質研究

2.2.1 感官評價結果

分別用傳統發酵劑和發酵劑B生產LBST-GMFM和LBSTL-GMFM。如圖3所示,LBSTL-GMFM感官評分高于LBST-GMFM,為88分。2種發酵乳在氣味、滋味和組織狀態上差異較大;LBST-GMFM質地粗糙、膻味重、酸香味淡、口感偏酸、有乳清析出,LBSTL-GMFM酸香味濃郁、酸甜適口、有輕微羊膻味、黏稠細膩、無乳清析出。LBSTL-GMFM膻味低、風味和組織狀態較好;這可能是干酪乳桿菌ZLC01能產胞外多糖,降解蛋白質和脂肪,產生大量的有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸[22];從而改善發酵乳的風味和組織狀態。王記成等[23]通過干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌復配發酵賦予了發酵乳細膩的口感、濃郁的乙醛風味。感官評價結果表明,將干酪乳桿菌ZLC01與傳統發酵劑共發酵,有助于發酵乳風味品質的提高。

圖3 山羊奶發酵乳感官評分圖Fig.3 Sensory scores of fermented goat milk

2.2.2 理化指標及乳酸菌活菌數分析

不同的發酵條件可改變發酵體系的酸度、凝乳pH值、黏度、持水力,影響發酵乳的組織狀態和滋味品質。如表3所示,干酪乳桿菌ZLC01顯著提高了LBSTL-GMFM的酸度、黏度、持水力和乳酸菌活菌數(P<0.05),且LBSTL-GMFM的pH值顯著低于LBST-GMFM(P<0.05)。酸度是發酵乳中總酸性基團物質的表征,如肽和游離氨基酸[10]。

表3 山羊奶發酵乳的基本理化指標及乳酸菌活菌數Table 3 Basic physicochemical indicators and live lactic acid bacteria count of fermented goat milk

LBSTL-GMFM的pH值較低、酸度高,而感官評分較好。這可能是低溫長時發酵條件下,發酵劑將脂肪和蛋白充分降解為氨基酸、肽和脂肪酸等物質,從而有效提高了LBSTL-GMFM的酸度和乳酸菌活菌數[16]。這不僅賦予發酵乳更為濃郁的酸香味,還避免了高溫短時發酵帶來的乳酸含量高、口感粗糙、乳清析出和風味不足等問題。此外,黏度和持水力反映發酵乳蛋白凝膠結構的穩定性,黏度和持水力下降會導致發酵乳乳清析出、質地粗糙[24]。LBSTL-GMFM較高的黏度和持水力,形成較穩定的凝膠結構,增強了LBSTL-GMFM的質地和口感。FAN等[16]通過干酪乳桿菌和傳統發酵劑共發酵,有效提高了發酵乳中脂肪酸、氨基酸和胞外多糖的含量,賦予發酵乳更佳的質地和口感,與本研究結果相似。綜上,復配干酪乳桿菌ZLC01發酵,可充分地將羊乳的蛋白質和脂肪水解為氨基酸和游離脂肪酸等物質、促進菌體胞外多糖產生,增加發酵乳酸香味的同時改善發酵乳的組織狀態。這可能是LBSTL-GMFM膻味低、酸香味濃郁、組織狀態較好的原因。下一步可通過代謝組學探究代謝物對發酵乳品質的影響。

2.3 山羊奶發酵乳代謝物研究

2.3.1 PCA和OPLS-DA

基于LC-QE-MS結合多元統計分析,探究發酵乳的小分子代謝物(多元統計分析結果見電子版增強出版附圖1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207,下同)。PCA顯示2組發酵乳在代謝物水平上存在差異,OPLS-DA結果顯示,2種發酵乳被分離為兩個單獨的集群;正、負離子模式下模型的R2Y分別為0.998和1,Q2分別為0.791和0.943;R2Y、Q2值接近于1,表明此模型能很好的解釋2種山羊奶發酵乳代謝物的差異。對模型進行200次置換檢驗,正、負離子模式下,置換檢驗模型的R2Y和Q2值均小于原模型,說明模型可靠性高,可根據VIP值篩選差異代謝物。

2.3.2 差異性代謝物的篩選

基于OPLS-DA結果,以VIP>1.5,P<0.05以及|log2FC|>1為條件篩選差異代謝物(差異代謝物含量見電子版增強出版附表1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207)。如圖4-b所示,正、負離子模式下,共鑒定到58種差異代謝物,主要包括16種氨基酸、肽及其衍生物,9種脂肪酸及其衍生物,8種核苷酸及其衍生物,7種芳香類化合物,4種生物堿和14種其他類化合物。對差異代謝物進行聚類和可視化分析(圖4-a、圖4-c),LBSTL-GMFM中44種代謝物下調,14種代謝產物上調;上調的代謝物為4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、4-羥基苯乙烯、(E)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯醛、絲衣霉酸、喹啉、尿囊素、L-色氨醇、苯乳酸,主要以氨基酸、肽及其衍生物和脂肪酸類化合物為主。其中,4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸這5種物質相對含量分別為LBST-GMFM的12 541、8 601、8 499、1 448、314倍,可作為LBSTL-GMFM的特征代謝物。

a-差異代謝物聚類熱圖;b-差異代謝物分類圖;c-LBST-GMFM中上調差異代謝物的Log2 FC絕對值

氨基酸、肽及其衍生物能改善羊奶發酵乳的風味品質,賦予發酵乳酸甜的口感;含甘氨酸、丙氨酸和天冬氨酸殘基的肽呈酸味、含谷氨酸的肽呈鮮味[10]。N-甲酰-L-蛋氨酸可通過美拉德反應生成醛類和硫類等風味物質[25]、酪氨酰脯氨酸有抗血壓、抗腫瘤[26]等功能活性;大多數的L型氨基酸呈苦味、L-酪氨酸與甜味相關、L-苯丙氨酸和L-亮氨酸與苦味有關[27]。本研究中,LBSTL-GMFM中L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、2-呋喃酰甘氨酸等相對含量低于對照組,谷氨酰胺丙氨酸、酪氨酰脯氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、L-色氨醇等相對含量較高;這可能是LBSTL-GMFM風味和酸甜味更佳的原因。此外,發酵乳中的氨基酸能和還原糖發生美拉德反應生成香氣閾值較低的揮發性醛類物質[28];干酪乳桿菌可以利用氨基酸作為氮源,促進嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長[29],增加胞外多糖含量,從而改善發酵乳的組織狀態;這可以解釋LBSTL-GMFM氨基酸類代謝物下調,而風味和組織狀態更佳的原因。

脂質代謝物與發酵乳的風味品質密切相關,發酵乳中的脂肪酸源于微生物對原料乳中脂肪、蛋白質和乳糖的分解代謝[30]。LBSTL-GMFM中甲基富馬酸、苯乳酸、4-異丙基苯甲酸等相對含量高于對照組(P<0.05);這類物質不僅賦予LBSTL-GMFM濃郁的酸香味和滋味、增強凝乳性能,還有較好的功能活性[28]。其中,苯乳酸有廣譜抑菌作用[31],甲基富馬酸有抑菌、抗炎和免疫調節作用[32],4-異丙基苯甲酸與酸菜獨特的酸香味有關[33]。

綜上,LBSTL-GMFM的風味品質和營養價值優于對照組。N-甲酰-L-蛋氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、4-異丙基苯甲酸等物質賦予LBSTL-GMFM濃郁的酸香味和清爽的口感;干酪乳桿菌ZLC01具有較強的脂肪和蛋白質利用度,可通過氨基酸代謝改善發酵乳的風味品質和組織狀態;下一步,有必要對差異代謝物進行代謝通路富集分析。

2.3.3 差異代謝物通路分析

通過KEGG數據庫比對和通路相關性分析(代謝圖通路富集圖見電子版增強出版附圖2-a和附圖2-b),58種差異代謝物主要富集到6條顯著的代謝途徑,分別為苯丙氨酸代謝,維生素B6代謝,酪氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,氨酰-tRNA生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑。WANG等[34]研究表明,氨基酸是微生物的氮源,氨基酸物質的進一步代謝,會影響食品風味物質的形成,如酯和醇。本研究中的苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、酪氨酸代謝等代謝通路與氨基酸的代謝途徑相關,且氨基酸、肽及其衍生物為主要的差異代謝物;這表明,干酪乳桿菌ZLC01主要通過氨基酸的代謝路徑來改善山羊奶發酵乳的風味品質。

繪制了關鍵差異代謝物與代謝途徑間的關系圖(差異代謝物與代謝途徑關系見電子版增強出版附圖2-c)。在發酵劑作用下,羊乳中的蛋白質、糖類和脂類物質通過蛋白、脂肪的水解和氨基酸代謝途徑參與三羧酸循環[35]。甲基富馬酸由三羧酸循環中的順烏頭酸的衍生物衣康酸轉化而來[32]。酪氨酰脯氨酸由蛋白質水解生成;4-異丙基苯甲酸由乳酸菌混菌發酵代謝糖類和脂質等物質分解產生[33],賦予新型發酵乳濃郁的酸香味。此外,L-苯丙氨酸可經芳香族氨基轉氨酶生成苯丙酮酸,在乳酸脫氫酶的作用下轉化為苯乳酸[31],賦予發酵乳潛在貯藏功能;橙皮苷是甜味劑二氫查耳酮的前體物質,由L-苯丙氨酸轉化而來[36]。吡哆醛呈苦味,干酪乳桿菌可代謝吡哆醛分泌胞外多糖[37],增強凝乳效果;同時,吡哆醛還可以通過維生素B6代謝和酪氨酸代謝途徑產生多巴胺,從而減輕L-酪氨酸帶來的苦味[38]。維生素C具有較強的抗氧化活性和柔和的酸甜味[33],主要由干酪乳桿菌通過山梨糖途徑代謝葡萄糖和2-酮基-L-古洛糖酸生成[38]。LBSTL-GMFM中吡哆醛含量低,橙皮苷和維生素C的相對含量顯著高于對照組(P<0.05),這說明干酪乳桿菌ZLC01主要通過苯丙氨酸代謝、維生素B6代謝和酪氨酸代謝,改善LBSTL-GMFM的滋味和質地。

3 結論

干酪乳桿菌ZLC01有效改善了山羊奶發酵乳膻味重、組織狀態差、乳清析出嚴重等問題。LBSTL-GMFM的酸度[(107.26±4.75) °T]、黏度[(1 952.93±21.95) mPa·s]、持水力[(97.17±2.36)%]和乳酸菌活菌數(2.06×109CFU/g)均高于對照組(P<0.05)。4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸是LBSTL-GMFM的特征代謝物,其主要通過苯丙氨酸代謝,酪氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等途徑生成。4-異丙基苯甲酸和酪氨酰脯氨酸與LBSTL-GMFM濃郁的酸香味有關,維生素C呈酸味、橙皮苷呈甜味、甲基富馬酸有抑菌作用,這些特征性代謝產物賦予LBSTL-GMFM較好的滋味和防腐保鮮作用,共同改善發酵乳的風味品質。本研究可為山羊奶風味改善和山羊奶發酵乳的研發提供科學依據。