重組荔枝類甜蛋白的高效表達、純化及活性鑒定

曹琳彩,文舜華,王凱,劉旭煒,胡卓炎,趙雷,沈興

(華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

荔枝(LitchichinensisSonn.)在世界各地的溫暖氣候地區廣泛栽培[1],其果肉中含有多種營養成分,如多酚、多糖等,據報道對肝、心、脾等有諸多益處[2],然而部分人群一次大量食用荔枝果肉會導致“上火”等不良反應[3]?！吧匣稹笔窃从谥嗅t學的一種概念,表現為局部發紅、發熱、疼痛,類似炎癥或炎癥性疾病[4]。這種食物不良反應對荔枝市場發展產生了影響。研究表明導致“上火”的食物含有促進炎癥的成分,如HUANG等[5]將荔枝定義為“熱性食物”并發現荔枝的水提取物增加了小鼠巨噬細胞RAW264.7中抗炎介質前列腺素E2(PGE2)的分泌與環氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)的表達,WANG等[6]使用RAW264.7細胞對荔枝中的水溶性成分進行了篩選,明確了荔枝中水溶性蛋白可以增加RAW264.7細胞系中促炎介質如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、COX-2、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及抗炎介質血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO-1)的產生。由此可見,荔枝中水溶性蛋白質是導致荔枝炎癥性“上火”的主要原因。本團隊前期研究發現,利用荔枝中分離純化得到的類甜蛋白(litchi thaumatin-like protein,LcTLP)刺激RAW264.7細胞,會顯著提高iNOS和COX-2的基因表達量以及炎癥因子分泌量[7],繼而推測LcTLP是食用荔枝引起炎癥反應的主要原因,但目前LcTLP分子晶體結構的解析以及其在細胞生命活動中的功能機制等還沒有深入的研究,因此大量的高純度的活性LcTLP獲取是急待解決的前提。

LcTLP可從新鮮果實中提取制備,但其產量低、周期長且純度不高[7],而重組表達則提供了更優的解決方案。有研究對TLP家族中的其他來源進行了異源表達實驗,但仍然沒有一個高效的方案,如MERVAT 等[8]通過使用載體pET-28a(+)在大腸桿菌中表達番茄TLP(NP24),證明該基因在大腸桿菌中作為包涵體過度表達。此外,余宇等[9]對小麥TLP構建的TLP-pET-32a載體在表達菌株BL21(DE3)中也為包涵體表達。因此,為避免LcTLP的原核表達形成包涵體,本研究采用融合標簽技術為大量表達可溶性LcTLP提供了解決途徑。NusA標簽(N-utilization substance A tag)能夠提高E.coli表達重組蛋白的溶解度和穩定性,如ZACHARCHENKO等[10]使用NusA標簽對人類蛋白磷酸酶1進行了高效的可溶表達。此外,適宜的純化策略也是獲得高純度、有活性的重組蛋白的必要前提。因此本研究采用融合NusA標簽和多組氨酸標簽(His6-tag)構建了重組LcTLP表達載體,對表達菌株進行了優化。此外,還建立了兩步法純化方案,對純化后的蛋白進行細胞炎癥活性實驗,為后續研究LcTLP在細胞生命活動中的功能機制奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原核表達載體pCold-NusA-thrombin site、克隆菌株E.coliDH5α,廣州艾迪生物科技有限公司;小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7,中國科學院細胞庫;TIAN prep Mini Plasmid Kit、表達菌株BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43、BL21(DE3)感受態細胞,天根生化科技有限公司;BamH I、Hind Ⅲ內切酶、Fast Digest限制性內切酶,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,北京雅安達生物技術有限公司;AGE預混膠試劑盒,英國gene fist公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、咪唑、溶菌酶、蛋白酶抑制劑100X、NO試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;低分子質量蛋白質marker、DNA連接試劑盒,德國Takara公司;全能核酸酶,翌圣生物科技(上海)股份有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉,英國Oxoid公司;100%Triton,Sigma公司;凝血酶,北京索萊寶科技有限公司;MTT細胞毒性試劑盒,南京建成生物工程研究所;其他化學試劑均為國產分析純。

PCR儀、Nano Drop 2000/2000C分光光度計,美國賽默飛公司;恒溫培養箱,日本三洋公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;SHA-CA數顯水浴恒溫振蕩器,常州榮華儀器制造有限公司;光柵型酶標儀,美谷分子儀器有限公司;高速大容量離心機,美國貝克曼庫爾特公司;蛋白質層析系統(AKTA start)、His trap FF、Hiload 16/600 superdex 75pg、超濾濃縮離心管,美國思拓凡公司;垂直電泳裝置、全能型成像系統,美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原核表達載體的構建

使用云舟生物在線網站對LcTLP基因(GenBank登錄號JF682821)進行大腸桿菌密碼子優化后,合成并插入pCold-NusA-thrombin site表達載體。將連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中,將菌液涂于氨芐平板上,在37 ℃下培養12 h,挑取單克隆菌落接入含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養基中,以220 r/min的轉速振蕩,37 ℃培養14 h后提取質粒,經測序鑒定正確的重組質粒命名為pCold-NusA-LcTLP。

1.2.2 重組蛋白誘導表達

分別取1 μL pCold-NusA-LcTLP質粒加入至BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43、BL21(DE3)感受態細胞中。采用熱激法進行重組質粒的轉化,冰上孵育30 min,42 ℃熱激45 s,在冰上孵育3 min。接著加入950 μL預熱的LB培養基,37 ℃搖床孵育60 min。孵育結束后離心去除上清液重懸涂板。將菌液涂布在相應抗性的LB平板上,37 ℃恒溫培養16 h。挑取單菌落至LB抗性培養基,37 ℃、200 r/min培養過夜。加入1%(體積分數)擴增菌液于TB抗性培養基中,37 ℃、200 r/min條件下培養3 h后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)至0.1 mmol/L,以未添加IPTG作為對照組,15 ℃、200 r/min繼續培養20 h后終止。收集菌液進行離心,棄上清液,重懸于4×裂解緩沖液(0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris pH 8.0、10%(體積分數)甘油、0.5%(體積分數)Triton、1 mmol/L 3,5-二硝基水楊酸、1 mg/mL溶菌酶、1×蛋白酶抑制劑100X、2 mmol/L EDTA),于液氮和37 ℃水浴中反復凍融3次后,置于37 ℃、200 r/min恒溫振蕩30 min。然后加入5 mmol/L MgCl2溶液和25 U/mL全能核酸酶,4 ℃反應30 min后10 000 r/min離心30 min,取上清液過0.45 μm濾膜,進行后續純化步驟。將收集的細菌裂解液上清液與誘導前對照組裂解液進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 重組LcTLP的純化

1.2.3.1 親和層析純化與酶切

采用5 mL His Trap FF鎳親和柱進行第一步純化。首先用緩沖液A[0.5 mol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris pH 8.0、10%(體積分數)甘油、0.5%(體積分數)Triton]平衡3～5個柱體積后進行上樣,設定3 mL/管進行收集。上樣結束后,以10%(體積分數)緩沖液B(緩沖液A的基礎上增加40 mmol/L咪唑)對柱子上結合的雜蛋白進行洗脫,然后提高咪唑濃度至200 mmol/L對目的蛋白進行洗脫。將相應的洗脫峰進行SDS-PAGE檢測,收集目的蛋白溶液用NanoDrop測定其濃度,每1 mg蛋白樣品中加入0.3 U凝血酶,37 ℃水浴反應2.5 h以切除NusA標簽。

1.2.3.2 凝膠過濾層析純化

采用Superdex75凝膠柱進行第二步純化。首先用緩沖液(150 mmol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris pH 8.0)平衡1個柱體積,然后將上一步純化得到的蛋白溶液用30 kDa V型超濾濃縮管濃縮至5 mL進行上樣,設定3 mL/管進行收集,繼續運行1.2個柱體積后結束程序,將收集到的洗脫峰進行SDS-PAGE檢測,選取符合目的蛋白大小的洗脫峰留存備用。

1.2.4 Western blot檢測

參照WANG等[11]報道的方法并略作修改。取純化后重組LcTLP經SDS-PAGE后,以200 A恒壓電流轉移55 min至0.22 μm PVDF膜上,再將膜放入含50 g/L脫脂奶的TBST(Tris buffered saline with Tween-20)中,室溫封閉1 h。加入1∶3 000(體積比)鼠抗His6標簽單克隆抗體,4 ℃過夜后用TBST洗膜3次,再加入1∶5 000(體積比)的HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗,室溫反應1 h,用TBST洗膜3次,最后加入超敏發光液,在凝膠成像系統成像,檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.5 重組LcTLP產量與純度測定

重組LcTLP的純度使用Image Lab軟件進行分析[12]。取每1 L培養基中提取過程中裂解上清液中的總蛋白、NusA-thrombin-LcTLP、重組LcTLP的濃度根據BCA試劑盒的方法檢測并根據濃度與該提取步驟的體積進行換算得到蛋白質總量。將BCA試劑A與試劑B按50∶1(體積比)比例混合均勻,制成BCA工作液。25 mg/mL蛋白標準溶液用10 mmol/L K3PO4緩沖液分別稀釋質量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標準品,同時樣品組稀釋多種不同的濃度。在標準品和樣品中加入200 μL的BCA工作液,37 ℃孵育30 min,使用酶標儀測定562 nm處的吸光度,制作標準曲線y=0.631 2x+0.185 9計算樣品蛋白的濃度。

1.2.6 重組LcTLP的生物活性鑒定

1.2.6.1 細胞培養與模型建立

將小鼠RAW264.7細胞在含體積分數10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素雙抗液(均為體積分數)的DMEM培養基中培養(37 ℃、5% CO2),取對數生長期細胞用于進一步實驗?？瞻讓φ战M加入等體積的培養基,陽性對照組加入1 μg/mL的LPS,樣品組分別加入用培養基稀釋為1、2 μg/mL質量濃度的重組LcTLP。

1.2.6.2 細胞存活率的測定

細胞存活率測定參照劉素貞等[13]的方法。取對數生長期細胞,以1×105個/孔的密度將細胞接種在96孔細胞培養板中培養12 h使細胞完全貼壁,移去培養基后分別加入1 μg/mL質量濃度的LPS、1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP進行對比。刺激細胞24 h后,移去細胞培養板上的溶液,在遮光條件下,向各孔中加入含CCK-8的培養液200 μL,在37 ℃培養箱中繼續培養1 h后,使用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光值。

1.2.6.3 細胞NO分泌量的測定

取對數生長期的RAW264.7細胞接種于96孔細胞培養板中,分別用1 μg/mL的LPS,1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP培養24 h后,取上清液使用試劑盒測定NO的分泌量。

1.3 數據處理

在SPSS軟件上使用單因素方法分析對實驗數據進行處理,P<0.05表示具有顯著性差異。實驗數據采用平均值±標準誤差表示,使用Origin 2018軟件進行圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 LcTLP表達載體構建與密碼子優化

不同生物體的密碼子使用方式存在的差異會影響到異源表達系統中目標基因的表達水平。密碼子優化是通過克服與密碼子使用和轉移RNA(tRNA)豐度的物種特異性差異相關的限制來提高翻譯率,增強蛋白表達與穩定性[14]。有效密碼子數(effective number of codons,ENC)是評價基因整體密碼子偏好性中最有參考價值的參數之一。ENC值描述的是某個基因的密碼子偏好程度,ENC值越低,說明密碼子使用偏好性越強[15]。以GenBank公布的LcTLP基因為模版,進行密碼子優化,前后對比如圖1-a所示。通過EMBOSS在線網站對密碼子優化前后ENC值和GC含量進行評估,優化前后的ENC值分別是52.56和47.15,GC含量無明顯變化,分別為48.66%和50.67%,說明優化后的密碼子更利于LcTLP在大腸桿菌中的可溶性表達。將優化后的LcTLP基因序列直接合成并插入載體pCold-NusA-thrombin site中,轉化至E.coliDH5α感受態中得到轉化子,通過擴大培養提取重組質粒,質粒圖譜見圖1-b。該質粒中,NusA標簽基因與LcTLP基因之間含凝血酶酶切位點,LcTLP基因另一端則含有His6標簽基因序列,經測序后表明該載體構建成功。

a-序列對比圖;b-質粒圖譜

2.2 重組蛋白NusA-LcTLP的表達優化

本研究中初步采用了3種不同的菌株對重組蛋白NusA-LcTLP進行誘導表達,結果如圖2-a所示,可以看出3種菌株表達的重組蛋白含量均不高,但BL21(DE3)pLysS菌株表達裂解后的背景更為干凈,雜蛋白比例低。BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43和BL21(DE3) 3種不同的大腸桿菌宿主細菌在使用T7啟動子時具有不同的蛋白質表達水平[16-18]。其中,BL21(DE3)pLysS菌株含有T7溶菌酶的基因,該基因作用于大腸桿菌細胞壁中的肽聚糖以溶解細菌,減少目標基因的背景表達卻不干擾IPTG誘導的表達,使其更適合表達有毒蛋白[19]。相比其他2種基因型的菌株,該基因型菌株對降低目的基因的表達背景水平效果最好,有利于簡化后續純化蛋白的步驟,提高蛋白純度,因此選用BL21(DE3)pLysS菌株作為表達菌株進行表達條件的優化。圖2-b為優化后的表達效果,可以看出裂解菌體離心后的上清液在80 kDa左右有明顯的NusA-LcTLP特征蛋白條帶出現,其中NusA分子質量為54.87 kDa。His6標簽分子質量為0.81 kDa,LcTLP含223個氨基酸殘基,分子質量約為24 kDa,因此NusA-LcTLP理論分子質量約為80 kDa。作為對照的未誘導重組菌體中無該蛋白條帶,說明成功表達得到了NusA-LcTLP重組蛋白。

2.3 NusA-LcTLP親和層析純化結果

由于目的蛋白NusA-LcTLP帶有His6標簽,首先采用Ni-NTA進行親和層析純化。收集不同咪唑濃度緩沖液洗脫得到的組分,進行SDS-PAGE檢測(圖3)。結果顯示,在使用不含咪唑的緩沖液A以及含40 mmol/L咪唑的洗脫液沖柱時,洗脫液中僅含少量目的蛋白,而使用含200 mmol/L的咪唑洗脫時可得到較純的NusA-TLP,表明通過此方法可以較有效地初步分離NusA-LcTLP。收集200 mmol/L咪唑洗脫得到的目的蛋白進行后續酶切實驗將NusA標簽與重組LcTLP分離。

圖3 NusA-LcTLP親和純化產物SDS-PAGE圖Fig.3 NusA-TLP affinity purification product SDS-PAGE analysis

2.4 NusA-LcTLP酶切與Western blot驗證

采用凝血酶對NusA標簽與重組蛋白進行切割分離,從圖4-a可以看出,酶切后NusA-LcTLP中的NusA標簽和重組LcTLP被成功切割分開,電泳中出現2條相應大小的條帶。重組LcTLP在SDS-PAGE結果中出現在29 kDa附近,略高于計算分子質量24 kDa。原因可能是由于His6標簽中包含多個帶正電荷的組氨酸,因此目標蛋白的電荷狀態發生了改變,進而影響了它在SDS-PAGE中的表現,使其分子質量的測量結果偏大[20]。圖4-b Western blot結果顯示,酶切前免疫印跡最深處于80 kDa處,酶切后該位置的免疫印跡消失,24 kDa處出現了較深的免疫印跡,可以說明酶切成功。

a-SDS-PAGE圖;b-Western blot圖

2.5 凝膠過濾層析分離重組LcTLP

通過圖5可以看到,酶切產物經過凝膠過濾層析純化后得到2個洗脫峰,將不同的洗脫峰收集起來進行SDS-PAGE檢測。2個洗脫峰分別對應為泳道1為NusA標簽,泳道2為重組LcTLP。說明NusA標簽與重組LcTLP兩個蛋白可以很好地分離。電泳結果顯示,純化后的重組LcTLP條帶單一,經Image Lab軟件分析顯示純度達90%。

a-凝膠過濾層析分離酶切產物峰圖;b-SDS-PAGE圖

2.6 BCA法測定蛋白濃度與產量

如表1所示,經IPTG誘導后,每1L TB培養基中濕菌體裂解后離心上清液所得總蛋白含量為2 711.03 mg,經第1次純化后可得NusA-LcTLP 286.95 mg。通過酶切與凝膠過濾層析純化之后重組LcTLP總得量為36.26 mg。在CHEN等[7]的研究中,從100 g新鮮荔枝果肉中分離出果肉蛋白后經丙酮沉淀和PBS提取,使用不同飽和度的(NH4)2SO4沉淀進一步透析與凍干收集,可得純度為70%的4.5 mg LcTLP。與此相比,重組LcTLP的純度遠高于化學法提取的LcTLP。而FUCHS等[21]經過多重化學純化在120.2 kg成熟櫻桃中獲得約1 mg高度純化的櫻桃TLP(nPru av 5),但發現此法提取的nPru av 5上存在碳水化合物部分,因此該提取方法也無法運用于蛋白晶體結構解析的實驗中。FUCHS等[21]還對nPru av 5進行原核表達發現為包涵體表達,經變性純化后得重組nPru av 5產量為0.7 mg/L培養基。除nPru av 5外,多種TLP在原核表達中形成包涵體被報道,如番茄TLP[8]、小麥TLP[9]和百合TLP[22]等。綜上所述,本實驗通過助溶標簽載體的構建、密碼子和表達菌株的優化得到了重組LcTLP 36.26 mg/L培養基,實現了重組LcTLP在原核系統的高效可溶性表達,并成功建立了一種高純度的制備方法。

表1 BCA法測定蛋白濃度與產量Table 1 Determination of protein concentration and total amount by BCA method

2.7 重組LcTLP的生物活性鑒定

圖6顯示了不同濃度的LPS、重組LcTLP對RAW264.7細胞存活率和NO分泌水平的影響。由圖6-a可知3組樣品的細胞存活率均在100%以上,說明1 μg/mL LPS、1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP對RAW264.7細胞均無毒害作用且有一定的促進細胞生長的效果,該劑量可以用于后續實驗。

a-細胞存活率;b-NO分泌量

RAW264.7細胞來自小鼠巨噬細胞系,它們在控制免疫反應和炎癥方面發揮著重要作用。NO是炎癥過程中的重要信號分子[23],在機體內通常存在正常水平的NO,當巨噬細胞被激活時,它們會釋放高水平的NO并激活 NF-κB信號通路,從而導致促炎因子的分泌并引發炎癥反應,因此NO含量可用作炎癥水平的衡量[24]。由圖6-b可知,NO的分泌量隨著重組LcTLP的濃度升高均呈現劑量依賴性增加,陽性對照LPS組含量為19.74 μmol/L,與空白組有顯著差異,可以說明細胞炎癥造模成功。在1～2 μg/mL質量濃度范圍內,重組LcTLP的NO分泌量分別為12.75和14.68 μmol/L,是空白組的2.91倍和3.36倍,以上組分都顯著提高了細胞NO的分泌。在WANG等[25]的研究中,10 ng/mL LPS和荔枝果實中天然提取的LcTLP刺激RAW264.7細胞NO分泌量約分別為50和30 μmol/L,約為空白組的10和6倍?？梢哉f明與天然提取LcTLP一樣,重組LcTLP具有增強RAW264.7細胞分泌NO的效果,具有一定的促炎活性,為后續提供了實驗基礎。

3 結論

本研究通過密碼子優化、構建含助溶標簽NusA標簽和用于親和層析的His6標簽原核表達載體、表達菌株優化,建立了一種高效表達可溶性重組LcTLP的方法。經原核表達的結果分析最合適的表達菌株為BL21(DE3)pLysS。使用親和層析技術、酶切技術和凝膠色譜層析技術對原核表達的重組蛋白進行純化,經蛋白電泳與免疫印跡鑒定,證明成功高效表達并純化得到可溶性重組LcTLP,其產量為36.26 mg/L,純度達90%以上。此外,RAW264.7細胞炎癥活性驗證表明,經原核系統表達純化的LcTLP對RAW264.7細胞無毒害作用且能夠促進RAW264.7中NO的分泌量并呈現一定的濃度依賴性,說明了重組LcTLP導致巨噬細胞產生炎癥反應。證實了重組LcTLP具有一定的生物活性,可為后續蛋白結構解析與功能研究奠定基礎。