響應面法優化松針板栗黑米酒的發酵工藝

尤潔,宋飛飛,吳偉斌

(福建生物工程職業技術學院 藥學系,福建 福州,350007)

松針是松科松屬植物的葉子,因其形如針而得名。松屬植物是世界上分布廣泛、資源豐富、四季常綠的樹種之一,是可持續利用的再生資源[1]。松針是松屬植物主要的副產物之一,也是其主要藥用部位[2];板栗是一種富含糖、氨基酸、蛋白質、脂肪的營養及經濟價值高的植物果實,是人體必需脂肪酸、礦物質、維生素和膳食纖維的良好來源[3-4]。黑米酒,是一種以黑米為原料制作的酒[5],是純天然飲料,不加香精、糖和色素卻香甜醇厚,色澤鮮亮,綠色、原生態等特點使其在眾多發酵酒中脫穎而出,獨樹一幟[6-7]。

松針提取物含有豐富的水溶性黃酮、多種礦物質和維生素[8],具有抗炎、抗癌、降壓、抗氧化、清除自由基等作用[9-11],但現階段松針的應用仍處于原始狀態,其藥用價值和保健價值尚未得到開發[12]。板栗是一種藥食同源的農產品[13],糖分是其基本營養成分,因口感獨特、營養豐富而備受好評。但是,新鮮板栗貯藏條件苛刻,產量受季節限制,市場上鮮板栗深加工較少[14]。

將松針和板栗作為輔助性原料引入黑米酒的發酵工藝中,不但能提高它們的利用率和深加工開發力度,還可以改善傳統黑米酒的功能性,大幅提升其多糖含量和風味[15-16]。因此對松針板栗黑米酒的發酵工藝進行優化具有十分重要的意義。本文采用響應面法對松針板栗黑米酒的發酵工藝進行了優化,旨在為松針板栗黑米酒及其他新型風味發酵酒的價值提升及應用開發提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬尾松松針,采自福州鼓山;板栗、黑米均為市售;NaCl、無水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純,西安天茂化工有限公司;甜酒曲、米酒曲和小曲,紹興古越龍山釀酒有限公司;果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母(食品級),湖北安琪酵母股份有限公司;果膠酶(7 500 PGNU/g)、明膠、硅藻土、殼聚糖,成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱、HPX-9272MBE電熱恒溫培養箱,上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;800y多功能粉碎機,武義海納電器有限公司;FA2004電子天平,上海舜宇恒平科技儀器有限公司;SHB-B95A真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;WD-9415C超聲清洗器,北京六一生物科技有限公司;YM50Z智控型立式壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫療器械有限公司;不銹鋼正壓桶式過濾器,上海信步過濾設備制造有限公司;HL-10D蒸飯柜,浙江寧波趙記電器有限公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋,上海力辰邦西儀器科技有限公司;PHSJ-3F pH指示計,上海儀電科學儀器股份有限公司;酒精計,河北省武強縣同輝儀表廠;砂罐(5 L)裝、陶瓷瓶(0.5 L)裝,福建德化縣樸達陶瓷有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

松針板栗黑米酒釀造工藝流程如下,可分為前處理、主過程、后處理3個階段(圖1)。

圖1 松針板栗黑米酒釀造工藝流程Fig.1 Brewing process of pine needle chestnut black rice wine

原料前處理→蒸煮→淋飯冷卻→拌曲糖化→搭窩培菌→沖缸→主發酵→過濾→滅菌→裝瓶→陳釀→成品

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 前處理

選用新鮮嫩綠的松針;由于在試驗中使用的板栗和黑米均為市售,為保證試驗的可復制性和推廣性以及結果的精準性和可靠性,對選取的板栗和黑米進行了一定的質量分析及相關指標的測定。選取的板栗表面光滑且無裂痕,形狀端正,大小均勻,淀粉含量68%(質量分數,下同)、含水率55%、油脂含量1.5%、蛋白質含量5%、糖含量7%、灰分含量1%;黑米顆粒飽滿,無雜質,顏色均勻,淀粉含量77%、含水率12%、膨化度1.3、脂肪酸含量2.5%、蛋白質含量9%。

稱取20 g新鮮松針,清洗干凈,切成5 cm長,用50 g/L NaCl溶液浸泡12 h,水位沒過松針2 cm。將松針段在50 ℃恒溫干燥3 h至恒重后,將其粉碎到80目。用體積分數為60%的乙醇充分浸泡45 min。然后用內沸法加入80 ℃熱水中恒溫加熱30 min,料液比1∶20(g∶mL)。將松針粉過濾得到松針提取物;栗子去皮洗凈,栗仁切碎,無大顆粒即得栗粉。將黑米洗凈,室溫20 ℃,浸泡12 h后,取出瀝干;將由甜酒曲、米酒曲和小曲組成的復合曲(質量比5∶3∶2)在23 ℃的適量水中浸泡3 h活化。

采用松針提取物進行發酵,而不是直接將松針放入發酵,這樣可以防止發酵過程中因松針導致酒體變成青灰色,而內沸法可以有效提高松針中黃酮多酚類和多糖物質的溶出度,不僅不會減少松針中的活性成分,還能減輕酒中的苦澀感[17]。

1.3.2.2 蒸煮淋飯

稱取預處理過的黑米650 g和板栗末350 g拌勻,組成初始原料,把原料放在蒸飯箱內,在100 ℃下蒸45 min。將蒸熟的板栗和黑米取出,放在消毒過的紗布上,用冷開水沖至30 ℃左右。此操作步驟不僅可以降低板栗和黑米的溫度,增加水分,還可以使黑米表面光滑,使顆粒分離,透氣,有利于下一步混合酒曲和“搭窩”。這一過程要盡可能的快速進行,盡量避免將蒸好的板栗和黑米暴露在空氣中時間過長,造成細菌污染。

1.3.2.3 拌曲糖化

針對黑米糖化困難的實際情況,采用甜酒曲、米酒曲和小曲質量比5∶3∶2的組合,復合發酵[18]。將加工過的板栗、黑米和活性酒曲按照酒曲的添加量占原料質量的0.8%進行攪拌。將攪拌均勻的混合物放入砂罐中,將其表面做成一個倒喇叭狀的窩,用酒精擦拭砂罐內壁和罐蓋,并用無菌紗布覆蓋,嚴實密封,避免雜菌的污染。將其置于23 ℃的恒溫培養箱內進行糖化發酵,發酵后可出現菌絲體和糖液。糖化酶的活性在50 h左右達到最高,然后霉菌進入衰退階段,糖化酶的活性也隨之降低。因此,糖化反應的時間為48 h,之后進行發酵和成熟。

1.3.2.4 主發酵

考慮到酵母的生態喜好性和菌體量的平衡,將果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母按質量比1∶0.8∶1混合,加入體積分數2%的葡萄糖水,28 ℃活化50 min[19]作為較為適宜的酵母接種條件,能夠最大程度地促進發酵效率,從而得到了較好的黑米酒發酵效果。將活化的混合酵母加入砂罐中,加入30 g松針汁和500 g水,發酵液的初始還原糖質量濃度在100 g/L左右。然后在23 ℃的恒溫培養箱中進行主發酵。每8 h進行1次攪拌。測定每日的酒精含量及還原糖的濃度,直至還原糖的濃度穩定,發酵8 d左右,完成主發酵進程。

1.3.2.5 后處理

對砂罐中發酵物進行手動壓濾。將濾液置于4 ℃沉淀1 d,取上清液,加入明膠和殼聚糖復合澄清劑澄清,再用0.45 μm不銹鋼正壓桶式過濾器過濾。在85 ℃下加熱25 min后在110 ℃下進行超高溫滅菌15 s,然后快速冷卻。冷卻后裝入經高溫滅菌的陶瓷瓶中,即得試驗用酒。繼續在4 ℃和30 ℃溫度下交替陳釀,間隔10 d,共陳釀40 d,即得成品松針板栗黑米酒。

1.3.3 發酵工藝優化

單因素試驗:松針汁添加量[1%、2%、3%、4%、5%,質量分數(下同)]、板栗添加量(20%、25%、30%、35%、40%)、復合酒曲添加量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、混合酵母添加量(0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)、發酵溫度(24、26、28、30、32 ℃)和發酵時間(4、5、6、7、8 d)為影響因素,進行單因素試驗,采用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸態氮含量為主,感官評價為輔的評價指標體系,以此綜合考察各因素對松針板栗黑米酒品質的影響[20]。響應面試驗:在單因素試驗的基礎上,4個評價指標通過權重均衡化和離差標準化得出的綜合加權分作為響應值(Y),利用DesignExpert12軟件設計3因素3水平的響應面試驗(表1),確定松針板栗黑米酒的最佳發酵工藝參數。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.3.4 測定方法

酒精含量的測定:重鉻酸鉀氧化法;還原糖濃度測定:GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》直接滴定法;pH值、氨基酸態氮含量的測定:GB/T 13662—2018《黃酒》電位滴定法;非糖固形物含量的測定:GB/T 13662—2018《黃酒》重量法(仲裁法);水浸法:將經預處理的松針加入水中,于80～90 ℃恒溫下進行加熱。醇提法:在90 ℃下按料液比1∶20(g∶mL)進行浸提。內沸法:將經預處理的松針在50%(體積分數)的乙醇溶液中按料液比1∶1(g∶mL)充分浸沒,過濾后,將松針粉加入80 ℃的溫水中恒溫加熱[21]。

1.3.5 感官評定方法

感官評價小組由10名(5男5女)具有較強食品口感控制能力和相關經驗的食品專業人員組成,均已通過食品品質分析及其應用等專業課程,且經過預選、初選、終選和統一培訓等環節,以保證感官評價結果的可靠性和可信度。在預選階段,篩選了具有較好味覺和嗅覺能力的人員;在初選階段,將相關人員帶入實驗室進行初步的感官培訓和限制性培訓;在終選階段,選定了較為敏銳的人員作為感官評價人員,并對其進行進一步的感官評價統一培訓。

感官評價小組分別對松針板栗黑米酒的色、香、味、風格進行打分,總分100分,感官評價標準列于表2。

表2 松針板栗黑米酒感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standard of pine needle chestnut black rice wine

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface test design and results

1.3.6 統計分析

使用Design-Expert 12軟件,按照Box-Behnken中心組合實驗設計原則進行響應面試驗,使用SPSS 22.0統計軟件對試驗結果進行多重比較。使用Origin 2022軟件繪制圖表的組件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 輔料添加量對發酵工藝的影響

由圖2-a可知,當松針汁添加量為2%時,酒的非糖固形物含量達到了最高值25.3 g/L,酒精含量為13.6%,氨基酸態氮含量為0.48 g/L,感官評價為88分。當松針汁添加量超過2%時,醪液的發酵度降低,酒精含量不足,導致酒體不夠協調濃郁[22]。由圖2-b可知,板栗的最佳添加量為25%,在此添加量下,酒的非糖固形物含量為25.8 g/L,酒精含量為15.2%,氨基酸態氮含量為0.61 g/L,同時感官評價為90分。板栗添加量不足25%時,口感層次不夠豐富,感官評價偏低;而超過30%時,蛋白質含量較高,影響酒的渾濁度。因此,在進行綜合分析各指標含量和感官評價后,確定板栗與松針汁的最佳添加量分別為25%和2%。

a-松針汁添加量;b-板栗添加量

2.1.2 發酵劑添加量對發酵工藝的影響

由圖3-a可知,當復合酒曲添加量較少時,樣品的非糖固形物含量、酒精含量和氨基酸態氮含量均較低,感官評價也不高。隨著復合酒曲添加量的增加,在1.2%時達到最優,但添加量超過1.2%后,酒精含量顯著升高,感官評價則顯著降低,并出現較大的酸味。這可能是由于復合酒曲過多,導致發酵不完全或產生氣味,進而引發酸敗。圖3-b顯示,在松針板栗黑米酒中,隨著混合酵母使用量的增加,氨基酸態氮含量逐漸升高。當混合酵母添加量為0.10%時,非糖固形物含量達到最大值23.5 g/L,而酒精含量在0.04%～0.08%使用量范圍內隨混合酵母使用量的增加而逐漸升高,當添加量為0.08%時,酒精含量可達14.9%。但超過0.08%的添加量后,酒精含量反而會降低。經過綜合分析比較,最佳混合酵母使用量為0.10%。

a-復合酒曲添加量;b-混合酵母添加量

2.1.3 發酵條件對發酵工藝的影響

適宜的發酵溫度有利于酵母中微生物的生長代謝,促進發酵和酒精等生成物的產生,使黑米酒的香味更加豐富[23]。由圖4-a可知,發酵溫度升高時,酒精、非糖固形物和氨基酸態氮含量均先增加后減少,28 ℃時達到最佳值(非糖固形物含量26.1 g/L,酒精含量14.3%,氨基酸態氮含量0.58 g/L,感官評價90分)。發酵溫度過高則導致糖分消耗過多,酸含量過高,各指標下降。此外,圖4-b顯示,隨著發酵時間延長,非糖類固形物含量減少,而氨基酸態氮和酒精含量增加。發酵初期,糖分含量較高,而隨著時間推移,酵母轉化糖分生成乙醇,提高酒精含量。同時,酒曲中的蛋白酶分解蛋白質,形成氨基酸和多肽,增加酒香的刺激性,影響口感。綜合分析顯示,發酵溫度28 ℃和7 d的發酵時間是最佳條件。

a-發酵溫度;b-發酵時間

2.2 響應面優化發酵工藝試驗結果及分析

2.2.1 數字模型的建立及分析

以單因素試驗為基礎,對松針板栗黑米酒的發酵工藝進行了研究。以松針汁添加量(A)、板栗添加量(B)、發酵時間(C)作為影響因素,綜合加權分(Y)作為反應值,進行3因素3水平的響應面試驗。

2.2.2 響應面試驗方差分析

對試驗結果進行多元回歸擬合后,獲得各因素水平對松針板栗黑米酒綜合加權分(Y)影響的二次多項回歸模型:Y=-355.67+22.26A+2.56B+103.92C+0.26AB-0.10AC+0.02BC-6.48A2-0.060B2-7.21C2

表4 響應面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface test

采用Design-Expert 12軟件,通過Origin 2022繪圖,得到了松針板栗黑米酒的發酵過程的響應面和等高線,可以較好地反映各種因素以及它們之間的交互作用。響應面曲線越大,說明兩個因子之間的相互影響就越明顯。由圖5可知,松針汁添加量、板栗添加量與發酵時間的相互作用對綜合加權分的影響。響應面的開口都向下,且有最高值,圖5-a顯示,松針汁添加量和板栗添加量交互的等高線為橢圓,表明對結果有較大的影響,且與方差分析相吻合。

a、d-松針汁添加量和板栗添加量交互響應面及等高線圖;b、e-松針汁添加量和發酵時間交互響應面及等高線圖;c、f-板栗添加量和發酵時間交互響應面及等高線圖

2.3 最佳工藝參數確定與驗證

通過Design-Expert 12軟件分析,得到松針板栗黑米酒的最佳發酵工藝條件為松針汁添加量2.206 12%,板栗添加量27.325 3%,發酵時間7.229 62 d,模型預測的綜合加權分最大預測分值為79.492 5?？紤]到實際操作性,綜合調整發酵工藝參數為松針汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,發酵時間7 d,復合酒曲添加量1.2%,混合酵母接種量0.1%,發酵溫度28 ℃,取3次試驗數據的平均值,綜合加權分為80.13,結果表明,響應面模型與實際狀況吻合較好,可以有效地指導發酵過程的優化。

3 結論與討論

研究發現,采用黑米酒發酵工藝,使用松針和板栗作為主要輔料,通過使用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸態氮含量等指標體系進行綜合考察,感官評價作為輔助評價指標,來評價各因素對松針板栗黑米酒品質的影響。結果表明,松針和板栗是促進黑米酒品質的主要因素之一,它們對黑米酒的口感和品質影響顯著。在單因素試驗基礎上,響應面試驗得出最佳發酵工藝條件為:松針汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,發酵時間7 d,復合酒曲添加量1.2%,混合酵母接種量0.1%,發酵溫度28 ℃,最終酒精含量為15.8%。制得的松針板栗黑米酒呈玫瑰色,色澤亮麗,口感柔軟,酒體和諧。

松針含有豐富的揮發性精油和多種有機酸,板栗富含淀粉和單寧酸等營養成分,能夠促進松針板栗黑米酒的形成和口感的提升。通過對實驗結果及文獻的比對和分析發現,使用松針和板栗作為輔料,能夠顯著提升黑米酒的品質,這是一個具有潛力的釀造方式。未來需要進一步驗證實驗中的松針和板栗是否具有協同效應,探究板栗和松針對黑米酒釀造的影響機制,以提供更準確的理論支持來改進酒類生產工藝。