益生菌餅干的3D打印制備及研究

唐錦輝,謝娟娟,楊坤,朱慧彥,步夢源,賈東洋,劉耀文

(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625000)

益生菌是一種食用后可恢復或維持宿主體內的微生物種群、功能、組成和營養平衡的微生物,可產生各種分解食物成分的酶,因此益生菌食品被歸類為功能性食品[1]。益生菌對人體有多種有益功效,如抗癌、降低膽固醇、抗高血壓、調節免疫、治療腸道疾病等[2]。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri,LR)是一種革蘭氏陽性、存在于單個或多個簇中的兼性厭氧、專性異質發酵乳酸菌,LR的有益特性主要表現在兩個方面:1)LR可以黏附在腸道內部,從而減少其他有害細菌的定植;2)LR能產生細菌素(Reuterin),有害細菌在含有細菌素的環境中會被抑制,從而降低對人體的損害[3-4]。

益生菌只能在適宜的條件下儲存,并且只有在胃腸道條件下存活,才能發揮其作用。因此,對益生菌進行封裝常被用于提高其在加工、儲存過程中和胃腸道條件下的生存能力,從而確保益生菌輸送到胃腸道的目標位點并發揮作用[5]。然而,現有的大多數益生菌食品都需要加熱才能食用,但加熱處理會導致益生菌活性降低,影響其發揮作用。

食品3D打印技術是一種新興的食品加工技術,融合了數字技術、食品加工技術等多種技術。它具有可定制、營養價值高、安全等優點。能夠方便快捷地生產出滿足不同人群需求的食品。因此,3D打印技術在食品開發領域具有很大的研究潛力。目前使用的3D食品打印技術大多基于材料擠壓,即食品原料通過噴嘴,按特定圖型沉積在目標板上。該技術可實現連續打印,適用于液體或低黏度材料的食品制備。但擠壓式3D打印技術對食品原料要求嚴格,原料一般需要滿足一定的流變性能,能夠順利擠出的同時并保持一定形狀;另一方面,打印速度、打印溫度、填充率、噴嘴直徑等打印參數對打印效果也有較大影響[6]。

根據現有的研究表明,在益生菌食品領域,對LR的封裝研究以及3D打印后可直接食用的餅干研究較少。因此本研究制備了一種含有羅伊氏乳桿菌的益生菌餅干,用蛋清將LR進行封裝,制備LR封裝顆粒(LR-encapsulated particle,LEP),將其添加到熟小麥粉中制備益生菌餅干面團。對LEP的粒徑、聚合物分散性指數(polymer dispersion index,PDI)、掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、封裝效率(encapsulated efficiency,EE)和模擬唾液、模擬胃液、模擬腸液中LR的存活數量進行了檢測分析。并對餅干面團的傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、流變和質構特性進行表征,最后驗證了餅干面團的3D打印適應性,對益生菌3D打印食品的開發有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉,益海嘉里食品有限公司;無菌雞蛋,四川盛迪樂村生態食品有限公司;LactobacillusreuteriCICC 6132,中國工業微生物菌種收集與管理中心。其余試劑均為分析純,購自雅安市萬科試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano-ZS Zetasizer分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;SU 8010掃描電子顯微鏡,日本日立有限公司;Nicolet 6700 傅立葉紅外光譜儀,美國Thermo Nicolet分析儀器公司;Discovery HR-2儀器流變儀,美國 TA儀器公司;TA.XT Express C物性分析儀,英國Stable Micro Systems公司;3D打印系統,成都綠芯科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液的制備

將LactobacillusreuteriCICC 6132的二級純化培養液以2%的接種量接種于無菌MRS液體培養基中,在37 ℃恒溫培養箱培養36 h后,6 000 r/min離心20 min后收集細菌細胞。細菌細胞用無菌生理鹽水洗滌兩次,再次離心得到菌泥。使用前,將0.1 g菌泥加入適量的無菌生理鹽水中制備得到細菌懸浮液。

1.3.2 LEP及餅干面團的制備

LEP的制備方法:首先,將細菌懸浮液與一定質量的無菌雞蛋的蛋清在低速恒定磁力攪拌下逐滴地混合?；旌象w系中菌懸液與蛋清的質量比分別為1∶10、3∶10、5∶10、7∶10、9∶10。在室溫下攪拌15 min后,6 000 r/min離心20 min得到沉淀物,冷凍干燥24 h,制備得到不同比例的LEP粉末(1/10-LEP,3/10-LEP,5/10-LEP,7/10-LEP,9/10-LEP)。使用前,將干燥的LEP粉末溶解在5 mL無菌飲用水中制備得到LEP分散液。

餅干面團的制備:將小麥粉加入不粘鍋中,小火翻炒10 min至微焦,得到可生食的熟小麥粉。用分離器將無菌雞蛋的蛋清與蛋黃分離,然后將具有完整膜的蛋黃在濾紙上滾動,去除殘留的蛋清。刺破蛋黃蛋白膜后,收集蛋黃供后續使用。取蛋黃30 g密封在塑料袋中(密封前擠出塑料袋中的空氣),然后在80 ℃的恒溫水浴下10 min,得到煮熟的蛋黃。最后,將30 g煮熟的蛋黃和80 g的熟小麥粉用無菌玻璃棒混合后,分別加入5種不同比例的LEP分散液和25 mL無菌飲用水,充分混合,得到5種不同比例的可直接食用的餅干面團(1/10-面團,3/10-面團,5/10-面團,7/10-面團,9/10-面團)。同時以相同步驟制備不添加LEP分散液的純小麥粉面團,作為對照。該過程完成后,面團在4 ℃進行保存,以備使用。

1.3.3 模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液消化后LR的存活數量測定

模擬唾液消化是根據DING等[7]描述的方法進行了修改,將100.0 mg黏蛋白、15.0 mg KCl、12.0 mg NaCl、7.5 mg α-淀粉酶溶解于50.0 mL蒸餾水中制備模擬唾液。在10 mL模擬唾液中分別加入0.2 g LEP粉末和游離細胞懸液,在37 ℃孵育50 r/min持續攪拌3 min以模擬唾液消化。將10 mL模擬唾液與100.0 mg胃蛋白酶加入到50.0 mL蒸餾水中充分混合,再加入0.1 mol/L HCl溶液調節pH值至3.0制備模擬胃液。然后將含有LEP和模擬唾液的混合液,加入到制備好的10 mL模擬胃液中,放在攪拌器上,在37 ℃下,以50 r/min的速度攪拌3 h以模擬胃液消化。按照SANDOVAL-CASTILLA等[8]描述的方法模擬腸道消化,將4.0 mg/mL膽汁提取物、2.0 mg/mL胰蛋白酶和1.0 mg/mL脂肪酶置于0.1 mol/L PBS緩沖溶液中,加入0.1 mol/L NaOH溶液調節pH為8.0。將模擬胃液消化后的混合液,加入制備好的10 mL模擬腸液中。在搖床中37 ℃恒溫孵育3 h以模擬腸道消化。被封裝細胞和游離細胞的存活數量均以每毫升中菌落形成單位(colony forming unit,CFU)的常用對數值(即lg)來計算。

1.3.4 LR在LEP中的封裝效率測定

為測定LEP的封裝效率,將0.1 g LEP溶解在無菌生理鹽水溶液中,2 500 r/min離心15 min。梯度稀釋后,接種于MRS瓊脂平板上,在37 ℃下孵育48 h。測定CFU,計算LEP中的活菌數。以游離LR為對照,使用公式(1)計算封裝效率EE值[9]。

EE=C/C0×10

(1)

式中:C,LEP中被封裝LR數量的常用對數值;C0,游離LR數量的常用對數值。

1.3.5 LEP粒徑的測定

將干燥的LEP粉末用蒸餾水稀釋至一定濃度,使用Nano-ZS Zetasizer分析儀對其粒徑大小及其分布進行表征。

1.3.6 LEP的掃描電鏡分析

將所有樣品進行冷凍干燥后黏在樣品平臺上,在20 mA電流下進行噴金處理,時間為120 s。分別在200×和2 000×放大倍率下拍攝樣品的SEM圖像。

1.3.7 餅干面團及LEP的傅里葉紅外光譜的測定

將餅干面團、LEP分別磨成粉末狀(1 mg)與KBr粉末(100 mg)混合,在分辨率為4 cm-1的情況下,在500～4 000 cm-1處進行64次掃描,記錄光譜。

1.3.8 餅干面團的質構特性測定

使用物性分析儀P/0.5探頭測試3D打印產品的硬度、黏附性、彈性、黏性。

1.3.9 餅干面團的流變特性測定

平板直徑為40 mm,兩平行板間隙設置為1 050 μm,溫度設定為25 ℃。在應變0.4%時,分析了0.1～100 rad/s的動態振蕩頻率[10],并記錄了存儲模量G′、損失模量G″和正切損耗角tanδ。

1.3.10 餅干面團的3D打印適應性測定

3D打印系統由給料機、帶氣泵的擠出系統和X-Y-Z定位裝置組成。使用直徑(d)分別為0.5、1、1.5 mm的噴嘴來驗證餅干面團的3D打印適應性,打印速度設置為10、15、20 mm/s,氣泵壓力設置為300、350、450 kPa。當壓力設置為300、350、420 kPa時,打印速度恒定為15 mm/s,使用直徑為1 mm的噴嘴打印圓形餅干;打印速度設置為10、15、20 mm/s,壓力恒定為350 kPa,使用直徑為1 mm的噴嘴打印五角星形餅干;當噴嘴的直徑設置為0.5、1、1.5 mm時,打印速度恒定為15 mm/s,壓力恒定為350 kPa,打印方形餅干。

1.3.11 統計分析

實驗數據采用SPSS 22.0統計分析,所有數據均以平均值±標準差表示,每項實驗至少3次平行重復。通過單因素方差分析(ANOVA)進行分析,P<0.05為差異顯著,有統計學意義,使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 LEP的粒徑和掃描電鏡分析

LEP的粒徑、PDI及微觀結構如圖1所示。

a-粒徑;b-聚合物分散性指數;c-LEP的掃描電鏡圖

1/10-LEP的粒徑明顯小于其他比例的LEP,這可能是LR的數量較少,使得難以被封裝。粒徑大小通常由微觀結構之間的各種相互作用(如靜電力、疏水力)決定。當LEP比例為3/10時,粒徑突然增大,這可能是由于體系中的電子束通過靜電相互作用吸附在LR的表面,形成了細菌-蛋白質的核殼結構,導致LEP平均粒徑顯著增大(P<0.05)。微觀結構之間的靜電相互作用可以改變蛋白質分子的表面電荷,使得封裝顆粒之間的緊密度發生變化,從而減小封裝顆粒的粒徑。在圖1-c中可以驗證這一點,5/10-LEP和7/10-LEP的結構比3/10-LEP更小、更松散[11]。此外,隨著LR數量的增加,每個細菌上吸附蛋清的量減少,導致粒徑減小。當LR數量進一步增加時,細菌之間相互聚集,出現多個細菌被封裝在一起的情況。粒徑分布的均勻性可以用PDI來表征,PDI值越小,粒徑分布越均勻。LEP的PDI值在(0.37±0.04)～(0.81±0.03),說明LEP的分散性不佳。5/10-LEP的PDI最小(0.37±0.04),此時粒徑分布最均勻。不同尺寸下LEP的SEM圖像如圖1-c所示。LEP表面相對光滑,主要形狀為球形,但也有部分呈橢圓形。1/10-LEP的SEM圖像中,出現了除LEP以外的絮凝物,這可能是因為LR數量過少時,蛋清之間相互聚集形成絮凝物。隨著LR數量的增加,LEP的數量增加而絮凝物數量減少,證明蛋清成功實現了對LR的封裝。

2.2 LEP的封裝效率分析

LEP的封裝效率如圖2-a所示。LEP的封裝效率在(70.3±1.21)%～(83.5±1.25)%變化,總體上封裝效果較好。當菌懸液與蛋清添加比例為1∶10時,封裝效率較高的原因可能是體系中LR較少,LR被蛋清封裝較為完全。當菌懸液與蛋清添加比例為3∶10時,封裝效率最低,這可能是因為LR的部分聚集導致蛋清不能完全將其包裹,蛋清之間形成了較大空隙,從而降低了蛋清對LR的保護作用[12]。另外,過量的蛋清具有一定的黏度,使得LR難以分散,從而導致封裝效率的下降。隨著LR數量的不斷增加,LR的封裝效率先增大后減小,說明在一定范圍內蛋清能將LR進行封裝。但是隨著LR的不斷增加使得體系中蛋清的相對含量越來越少,更多的LR不能被封裝,導致封裝效率下降。也可能是隨著LR濃度的逐漸增加,LR在封裝顆粒表面和溶液中形成沉淀[13]。此外,封裝后的LR的活菌數量較高,說明蛋清與LR的相容性較好,蛋清封裝LR后不會破壞LR的結構而影響其活性。

a-LEP的封裝效率;b-模擬唾液中LR的存活數;c-模擬胃液中LR的存活數;d-模擬腸液中LR的存活數

2.3 模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液消化后LR的存活數量分析

LR消化過程中存活數的變化如圖2-b～圖2-d所示。模擬唾液消化3 min后,游離LR和LEP中LR活力無明顯差異。這可能是因為唾液的pH值為6.5～7,此pH下并不影響LR生存。唾液消化后的游離LR和LEP置于模擬胃液消化3 h后,游離LR和被封裝LR的存活數量均有所減少,但被封裝LR的減少數量小于游離LR。其中,3/10組游離LR的存活數量由(5.8±0.25) lg CFU/mL下降至(5±0.29) lg CFU/mL,是游離LR組中下降最多的組。巧合的是,3/10組LEP中LR存活數由(5.9±0.27) lg CFU/mL下降至(5.5±0.44) lg CFU/mL,也是被封裝LR中活菌數量下降最大的組,這可能與LR本身的生存能力相對較低有關。對LR進行封裝能夠使LR在酸性條件下具有更好的穩定性,并且在保持高活力的同時,延緩LR在胃中的釋放,從而順利到達腸道。有研究表明,被封裝的益生菌能更好地到達腸道[14-15]。與模擬胃液消化后相似,模擬腸液中游離LR和被封裝LR的存活數量進一步降低。被封裝LR存活數量略高于游離LR,下降的幅度低于游離LR。這一現象可能有兩個原因。首先,被封裝的LR可以應對系統中分子運動造成的熱損傷,具有更強的熱緩沖能力。其次,蛋清在酸性條件下可能發生變性,這使得LEP的結構變得更加致密,從而更好地保護LR。益生菌在腸道內的生存能力是評價其能否發揮作用的標準之一。因此,模擬唾液、胃液和腸液消化是評價益生菌功能的重要指標[16]。目前有研究表明,益生菌若要發揮其作用,需要在腸道中存活至少106CFU/mL或106CFU/g的活菌細胞[17-18]。由圖2-d可知,5/10-LEP,7/10-LEP以及9/10-LEP中的LR在模擬腸液消化后,仍能維持高于106CFU/mL的活菌數,表明被封裝LR可以在腸道中發揮益生菌作用。然而,只有兩組游離LR(7/10,9/10)的活菌數維持在106CFU/mL以上,由此可以判斷蛋清封裝后的LR能夠更好地定殖于腸道,發揮其益生菌功能。

2.4 餅干面團及LEP的傅里葉紅外光譜分析

5/10-面團、7/10-面團及LEP的FTIR如圖3所示。

a-LEP紅外光譜;b-餅干面團紅外光譜

2.5 餅干面團的流變特性分析

食品的黏度、儲存模量、損失模量等流變性能是評價材料打印性能的重要參數。食品材料的黏度是3D打印的關鍵因素[24]。適合基于擠壓的3D打印的材料應該具有適中的黏度,黏度不能過高以允許通過打印噴嘴,但也不能過低以支持逐層沉積、保持形狀[25]。從圖4-a可以看出,隨著剪切速率的增大,餅干面團的表觀黏度減小。此外,LEP的數量增加也會使得餅干面團的表觀黏度降低,這是因為作為LEP壁材的蛋清具有良好的吸水性。當蛋清吸收水分時,LR會同時利用其中的水分,從而導致面團的黏度降低。餅干面團的損失模量G″影響其擠壓行為,而儲存模量G′決定其支撐三維結構的能力[26]。從圖4-c可以看出,5種比例的面團G′均大于小麥粉,說明LEP的加入使得餅干面團具有了更高的機械強度。當面團中LEP的比例為5/10時,G′和G″均達到最大值,說明該比例的面團經過擠壓和打印后能良好地保持自身形狀。這可能是因為5/10-面團中添加的蛋清量和LEP的封裝效率恰到好處,LEP分散均勻在面團中形成了致密的三維網狀結構。G″為黏性響應,是應力與應變的比率,用于動態振蕩頻率分析。G″/G′(tanδ)>1主要表現黏性特性,<1則表現彈性特性。由圖4-b可知,所有比例的面團tanδ均小于1,含有 LEP的餅干面團均為黏彈性半固體,固體性能好、流動性差。在0.1～10 Hz的掃描范圍內,餅干面團的tanδ隨掃描頻率的增加呈現先減小后增大的趨勢。在高頻范圍內,餅干面團損失模量比例增大,導致系統結構不穩定,使得面團易從打印噴嘴處擠出。

a-表觀黏度;b-tanδ;c-儲存模量;d-損失模量

2.6 餅干面團的質構特性分析

從圖5可以看出,不同比例餅干面團之間的質構特性存在一定差異。與純小麥粉面團相比,5/10、7/10、9/10面團的硬度和黏性顯著提高(P<0.05),分別為114.61±3.91、120.43±0.86、116.82±2.15和72.04±2.63、73.77±2.9、71.61±1.94。黏附性也呈現出相同的趨勢,這可能與面團中的蛋白質含量有關。而餅干面團的硬度與制作過程中添加的水量有關,純小麥粉制成的面團可能含有更多的水分,而添加了LEP的面團可能會失去部分水分。這與面團流變特性形成的原因是一致的,都是因為LEP壁材蛋清的吸水性較好,而且LR也會利用面團的水分,導致其中的水分變少。面團的彈性是由小麥粉中蛋白質含量決定的,蛋白質分子之間相互作用形成三維網狀結構。蛋白質含量高,則三維網狀結構更穩定、更有彈性。由圖5-b可知,添加LEP后面團的彈性變化不大。而所有面團的彈性均較大,這是由于小麥粉中的麥谷蛋白亞基之間交聯從而形成了聚合物,麥谷蛋白之間形成了穩定的網狀結構,從而提高了面團的彈性。

a-硬度;b-彈性;c-黏附性;d-黏性

2.7 餅干面團的3D打印適應性分析

根據前面的性能分析,選擇5/10-面團,7/10-面團和9/10-面團進行3D打印,研究壓力、打印速度和噴嘴直徑對打印餅干外觀的影響,以打印的餅干外觀來驗證其3D打印適應性。從外觀上看,在適當的打印參數下,3D打印制備的餅干紋理清晰。原料的3D打印適應性直接決定了是否能進行3D打印,以及打印出來的食物形狀是否能隨著時間推移而保持。從圖6可以看出,3種比例的餅干面團均在15 mm/s,350 kPa,使用直徑(d)為1 mm的噴嘴的打印條件下,打印質量最好。如圖6-a所示,當壓力相對過小時,壓力不足以將面團推出噴嘴外,導致在打印過程中產生了不均勻的部分,其中包括雜亂的線條和明顯的斷點。當壓力較高時,餅干面團可以快速從噴嘴中擠出,但會造成紋理彎曲和堆積,導致餅干變形嚴重。從圖6-b可以看出,當打印速度太慢或太快時,擠出的面團無法跟隨設置的軌跡,則會導致彎曲、纏繞堆積、斷點等問題。如圖6-c所示,噴嘴直徑為1 mm時的表面結構最為光滑,噴嘴直徑的大小直接影響打印餅干的精度和表面粗糙度。噴嘴直徑越小,打印餅干的表面精度越高,打印所需時間越長。在氣壓恒定的條件下,噴嘴直徑越小,面團在擠壓時受到的壓力越大,在這種情況下,內部結構的完整性就無法保證。然而,較大直徑的噴嘴則會導致打印餅干的表面相對粗糙。這是因為從噴嘴擠出的大量面團破壞了預先設置的模型形狀,導致打印的質量較差。因此,在適當的打印條件下,3種比例(5∶10,7∶10,9∶10)面團的3D打印適應性均良好,得到的3D打印餅干均表現出良好的外觀。

3 結論

本研究制備了羅伊氏乳桿菌封裝顆粒LEP,將其加入到小麥粉中制備益生菌餅干面團,分析其物料特性及3D打印適應性。測量結果表明,LEP的粒徑較小。LEP的封裝效率較高,說明LR的封裝效果良好、LR存活率高。3種不同比例(5∶10、7∶10、9∶10)LEP中的LR在模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液的環境中均能維持高于106CFU/mL的活菌數,表明被封裝的LR可在腸道中發揮益生菌作用。當LEP中菌液與蛋清的添加量為5∶10加入到面團中時,面團的G′和G″均達到最大值,說明該比例LEP面團具有較高的機械強度,也說明該比例面團經過打印后能夠良好地保持自身形狀。在適宜的打印條件下,添加3種不同比例LEP(5∶10,7∶10,9∶10)的面團均表現出良好的3D打印適應性。