干腌火腿活性肽的抗氧化性能研究與鑒定

楊天志,張迎陽*,鄒平,董亞云,李錦,高蕙文,耿成鋼

1(常州大學 藥學院/生物與食品工程學院,江蘇 常州,213164)2(常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心,江蘇 常州,213022)

中國比較早的干腌制品是以金華火腿為代表的各種各樣的火腿和香腸,屬于低酸干腌肉制品[1]。干腌火腿加工過程比較復雜且時間久,其中活性肽大部分是源自肌動蛋白的降解。首先由內肽酶對蛋白質進行降解,之后結合外肽酶,在微生物酶與內源酶的共同作用下,蛋白質被分解為小分子肽和游離氨基酸[2]。這些多肽決定了干腌火腿的風味,并具有潛在的抗氧化和抗高血壓活性[3]。多肽的抗氧化活性歸因于許多特性的協同作用,包括螯合金屬離子、淬氧和清除自由基的能力。此外,抗氧化肽由于無毒、高效等特點[4],近年來受到越來越多的關注,MORA等[5]研究表明,干腌火腿中的蛋白質水解受原料和加工參數(如鹽含量、溫度、濕度和成熟時間)的影響。因此,不同時期的干腌火腿發生不同的蛋白水解反應,形成不同的肽序列。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可以作用于超氧陰離子進行專一歧化反應。在人體內可以高效的清除超氧陰離子自由基,治療一些由于自由基作用導致的炎癥、自身免疫病。另外在抑制癌細胞方面也有一定的作用。SOD最早是由FRIDOVICH研究發現的[6],并將這種血球銅蛋白命名為超氧化物歧化酶。同時活性肽與SOD的結合也可以提升清除自由基能力。

通過凝膠層析色譜和nano-HPLC-MS/MS分離并鑒定出抗氧化性能較好的肽段(DHDGPDHW、FPPDVGD、PFGDTH),對其進行合成并測試抗氧化性。借助分子對接實驗檢測DHDGPDHW、FPPDVGD、PFGDTH與SOD的結合能力,預測活性肽抗氧化機制,為活性肽的功能化研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:1年和2年的金華火腿,購于江蘇常州永輝超市。

試劑:谷胱甘肽(glutathione,GSH)、三氯乙酸、ABTS,北京百靈威科技有限公司;1,10-菲咯啉、DPPH、牛血清白蛋白,上海麥克林生化科技股份有限公司;HCl、NaH2PO4、H2O2、NaOH等,安耐吉化學有限公司。

從PDB數據庫下載SOD(PDB ID:2ADQ)蛋白結構;使用Pymol 2.3.0去除蛋白結晶水、原始配體等,將蛋白結構導入AutoDocktools(v1.5.6)進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。使用POCASA 1.1預測蛋白結合位點,采用AutoDock Vina1.1.2進行對接。

1.2 儀器與設備

HMS-901HS恒溫水浴鍋,博大精科實業有限公司;UPG-752紫外可見分光光度計,北京優普通用科技有限公司;M1416R臺式高速離心機,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;Labconco FreeZone 4.5 L真空冷凍干燥機,中科科爾儀器有限公司;PHSJ-3F pH計,上海雷磁儀器有限公司;JA1003精密電子天平,力辰邦西儀器科技有限公司;數顯高速勻漿機,馳勒機械科技有限公司;Orbitrap Q-Exactive Plus質譜儀、質譜分析柱(Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm);Hoffen-20-1傅里葉紅外光譜儀,天津市嘉鑫海機械設備有限公司;玻璃層析柱(26 mm×1 m),上海宸喬生物科技有限公司。

1.3.3 抗氧化性能的穩定性研究

1.3 我國康復醫學的發軔 隨著社會經濟文化的發展、醫療衛生事業改革的不斷深化以及生活水平的提高，醫學模式由生物醫學模式轉向生物-心理-社會的醫學模式。人們對醫療、疾病預防、殘疾出現后的康復有了更大期盼。中國現代康復醫學從1982年發軔，在機構設置、學科建設、人員培養、服務開展方面已形成一定規模和水平并且獨具特色[7]。我國康復醫學的中西醫結合的特點，更加富有東方醫學色彩，有很大潛力和發展空間。經過30余年的發展，符合我國實際的康復醫學理念、工作方式逐漸形成，以臨床康復醫學為主，以專業康復機構為骨干、社區為基礎、家庭為依托的多層次康復服務模式不斷完善[8]。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗肽的提取

根據鄭錦曉等[7]的方法進行修改,采用鹽酸提取法,將100 g肌肉切碎置于1 000 mL燒杯中加入500 mL 0.01 mol/L HCl溶液,再用勻漿機勻漿處理。勻漿后在10 000×g條件下離心15 min,然后將勻漿液用普通濾紙過濾,保留濾液,再加入3倍體積的乙醇沉淀上清液中的蛋白并過濾,濾液在低溫下靜置0.5 h,然后以4 000×g離心25 min。再用快速定性濾紙過濾,保留濾液,濾液再分別用0.45、0.22 μm濾膜進行過濾。取濾液在旋轉蒸發器(45 ℃)下旋轉蒸發除去乙醇,所得濃縮液冷凍后置于冷凍干燥機中干燥后得到粗肽,并儲存在-20 ℃冰箱中保存備用。多肽含量測定及標準曲線建立參考文獻[7]。

1.3.2 體外抗氧化活性研究

采用DPPH自由基清除法、ABTS陽離子自由基清除法、羥自由基(·OH)清除法,研究2個年份的火腿粗肽液在不同濃度下的抗氧化能力,對照組為同質量濃度的GSH。

DPPH自由基、·OH自由基、ABTS陽離子自由基清除作用參照文獻[8-10]所述方法測定。

根據洱海流域各樹種的年凈生長量計算的喬木林(純林和混交林)年碳儲量144339 t，其年碳儲量價值為1181.80萬元。

“你們不能這樣。我在老家就知道《小二黑結婚》《王貴與李香香》，我們現在是新中國的新女性，更要反對包辦婚姻。我不能嫁給楊連長，我堅決不同意。這個小伙子不行，就另找別人，反正我不嫁給又老又丑的楊連長。誰說也不行！”田志芳幾乎是瘋了一樣地喊叫著。

3.3.5 元數據維護。對平臺中的元數據，包括平臺中心前置庫、匯集庫、基礎庫、業務主題數據庫等庫表結構和數據資源的元數據的庫表結構、元數據關系進行統一的維護管理。

1.3.3.1 NaCl含量對粗肽抗氧化活性的影響

準確配制6份3 mg/mL火腿粗肽液,向配制好的粗肽液中分別添加0.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0% (質量分數) NaCl,在100 ℃、標準大氣壓條件下加熱20 min,冷卻至室溫,測定其抗氧化能力。

1.3.3.2 溫度對粗肽抗氧化活性的影響

準確配制5份3 mg/mL火腿粗肽液,分別在25、40、55、70、85 ℃水浴2 h后,快速冷卻至室溫,測定其抗氧化能力。

1.3.3.3 pH對粗肽抗氧化活性的影響

2.3 環境因素 二惡英是一種環境污染物，主要來源于焚化、再生資源的利用及除草劑和防腐劑等化學制品的生產，它通過擾亂雌激素分泌，免疫毒性，化學毒性致使DNA 受損、最后造成癌變。CYP1A1在二惡英類化合物的代謝中發揮著重要的作用，可激活多種致癌物質，異位子宮內膜組織的CYP1A1表達明顯升高。

韋蘭認為，在外部制度環境和內部道德秩序發生不連續性時，道德主體將有可能突破規則和傳統，拒絕外在制度的約束，形成道德焦慮。在城市化和逆城市化交互作用的今天，眾多村民要么告別熟悉的家園環境，背井離鄉去城市尋夢；要么懷揣著尋找機遇的美好愿望，成為新一代返鄉農民工創造商機。他們面臨陌生的外部環境、快速流動的人群和變動不居的習俗規范，約束人的道德秩序和道德行為也在發生轉變，屬于外部因素的道德觀念和道德標準影響著個體，能夠形成一種新形勢下的道德觀和道德秩序。道德失去了制度環境的外在效力，也使得他律將以一種全新的面貌得以呈現。

在干腌肉制品中,食鹽的添加是必不可少的。食鹽含量對抗氧化性的影響如圖2所示,在測定的區間范圍內,食鹽含量對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率影響不是很大,但是當食鹽質量分數高于6%時,對兩種自由基的清除效率有所下降,這可能是離子強度影響到氧化反應。從圖2-b中可以看出當溫度高于60 ℃時,粗肽的抗氧化活性有明顯下降的趨勢。這可能是由于小分子的短肽雖然不能像大分子的蛋白質一樣形成三四級結構,但是部分仍然具有二級結構,而二級結構對于抗氧化活性的保持具有重要作用。溫度太高不僅會破壞多肽的二級結構,也會使一部分小肽失活,這樣抗氧化成分就會受到影響,從而造成抗氧化活性的減弱。由圖2-c可知,火腿粗肽液在中性和弱酸的條件下能較好的保持其抗氧化活性,可以將干腌火腿抗氧化肽開發成中性或者弱酸性產品。但是pH>7之后,肽活性急劇下降,受堿性條件影響較大。一般來說,堿性條件導致金華火腿粗肽液活性下降的因素有多種,可能是由于肽的化學結構發生消旋[13-14],也可能是氧化反應受到pH的影響,堿性條件促進其氧化。

參照JING等[11]的方法,取不同年份火腿多肽提取物2 mg,置于KBr壓片上,用FT-IR掃描儀進行全波段(400～4 000 cm-1)掃描。剪切酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)的數據用Peakfit v4.12軟件進行分析,先進行基線校正,去卷積后,計算多肽各二級結構含量,用Origin 8.0軟件處理圖形。

1.3.5 抗氧化肽分離鑒定

根據抗氧化實驗結果,將1年份的金華火腿粗肽液進行分離純化,用凝膠層析色譜(SephadexG-25)進行純化[12]。蒸餾水經過45 μm濾膜過濾后作為洗脫液,調節流速0.5 mL/min,每管收集0.6 mL洗脫液,分別進行抗氧化性能測試。

Nano-HPLC-MS/MS分析:將樣品經由配備在線鈉噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nanoLC 1200的Q Exactive Plus質譜儀。共上樣5 μL樣品,以60 min的梯度分離樣品,柱流量控制在300 nL/min,柱溫40 ℃,電噴霧電壓2 kV,梯度從2%的B相起始,在47 min以非線性梯度升高到35%,1 min內升高到100%,維持12 min。

1.3.6 分子對接

“轉發這條錦鯉，好運不斷，心想事成?！?018年，上述表達在中國社交媒體上掀起數次狂歡。只要你能在小概率事件中“人品爆發”，展現超常運氣，你就是“錦鯉本鯉”。

1.3.7 數據分析與統計處理

準確配制5份3 mg/mL火腿粗肽液,pH值分別調節為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0并編號,然后室溫靜置1 h,將各溶液pH值調至7.0,測定其抗氧化能力。

實驗中用Origin 2018繪圖,分子對接部分采用Pymol 2.3.0進行處理,使用Microsoft Excel統計數據。

2 結果與分析

2.1 粗肽提取

在0～10 mg/mL牛血清白蛋白與吸光度的線性關系良好,線性標準方程為y=0.052 3x+0.003 1;R2=0.999 3,計算得出1年火腿粗肽、2年火腿粗肽含量分別為1.48、1.13 mg/mL。

2.2 體外抗氧化作用分析

由圖1可知,隨著GSH和粗肽濃度的升高,對·OH、ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的清除效果均成上升的趨勢,經計算1年和2年火腿粗肽液對·OH清除率IC50值分別為7.335、8.717 mg/mL;對ABTS陽離子自由基清除率IC50值分別為2.773、3.528 mg/mL;對DPPH自由基清除率IC50值分別為3.901、6.303 mg/mL。當粗肽質量濃度為5 mg/mL時,1年和2年火腿粗肽液對·OH的清除效果分別為35.52%、30.02%;對ABTS陽離子自由基的清除效果分別為69.98%、61.98%;對DPPH自由基的清除效果分別為59.24%、45.34%。由此可見加工1年的金華火腿粗肽液的抗氧化能力明顯高于加工2年的。這是由于多肽的抗氧化能力大多與氨基酸組成、分子質量大小有著密切聯系,一般抗氧化肽是由2～20個氨基酸組成,研究發現肽的分子質量越小,就越容易被人的腸道吸收,更容易穿過腸道發揮抗氧化活性。但是加工的時間越久,小分子的肽會逐漸降解成游離氨基酸,所以2年火腿的抗氧化能力要略低于一年份火腿的抗氧化能力。

a-·OH清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-DPPH自由基清除率

2.3 抗氧化穩定性分析

1.3.4 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析

本研究已獲本院醫學倫理委員會批準，并與患者家屬簽署知情同意書。選擇2017年1-9月于山東省青島市市立醫院擇期全麻下行全髖置換術老年患者60例，年齡65～75歲，體重50～80 kg，ASA分級Ⅰ～Ⅱ級。排除標準：(1)術前長期失眠、精神分裂、抑郁癥或認知功能障礙者；(2)近期接觸酒精、精神類或麻醉藥物史；(3)既往患有腦血管疾病或肝腎功能異常；(4)術前電解質酸堿平衡紊亂。采用隨機數字表法，將患者隨機分為對照組(C組)和褪黑素組(M組)，每組30例。兩組患者性別構成、年齡、體重等均無明顯差別(P>0.05)。見表1。

a-NaCl對抗氧化活性的影響;b-溫度對抗氧化活性的影響;c-pH對抗氧化活性的影響

2.4 FT-IR分析

圖3 不同年份的多肽提取物紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of peptide extracts in different years

2.5 抗氧化肽的分離鑒定

2.5.1 粗肽的分離鑒定

凝膠過濾色譜純化法是一種比較常見的純化多肽的方法,操作簡單,回收方便。主要是根據待分離組分的分子質量或者分子的形狀進行分離,大的蛋白分子不能進入凝膠顆粒,從而先被洗脫,小分子進入凝膠顆粒,但是在凝膠中的保留時間也不一樣,進而分離出分子質量不同的多肽。由表1可知,火腿粗肽經由SephadexG-25分離后得到了5個組分,其中組分B抗氧化性能最好。

表1 不同組分的抗氧化能力 單位:%

收集組分B,經過Nano LC-MS/MS共鑒定出1 276條不同的肽段,大部分肽段來自于參與各種類型細胞運動的肌動蛋白。通過與數據庫比對,挑選得分>97且豐度最多的前31條肽進行研究。通過研究發現,表2中的小分子多肽以較高的豐度被檢測到[16],并且被de novo檢測認為可信,通過與MS譜圖數據庫對比是一些全新肽段,得分>97的。由質譜結合軟件分析粗肽的氨基酸序列[17],得到活性高的氨基酸序列分別為:DHDGPDHW、FPPDVGD、PFGDTH。

3、專家咨詢費管理的標準。專家咨詢費是指臨時受聘的專家所取得的費用，其標準按國家有關規定執行。專家咨詢費在實際中爭議較少，主要是專家咨詢費的標準普遍不明確，存在較大隨意性。同時，存在以虛構人員名單等方式虛報冒領或者套取專家咨詢費的情況。

表2 鑒定到的小分子多肽Table 2 Identified small molecule polypeptides

2.5.2 合成肽的抗氧化活性分析

為了驗證鑒定的肽活性,按照肽的序列進行人工合成,并測定了合成肽段的抗氧化活性[18],結果如圖4所示,所合成的3條肽段對3種自由基都有清除效果。其中,清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基活性最強的肽段為FPPDVGD,分別為82.34%和84.22%?！H清除能力最好的肽段則是DHDGPDHW?？寡趸幕钚缘膹娙跬ǔＥc氨基酸組成和分子質量大小有關。大量研究表明,肽段分子質量在500～1 800 Da具有比較好的抗氧化活性[19],其中所含的氨基酸排序和種類也可以提升肽段的抗氧化活性,如果肽段中含有一個或幾個疏水性氨基酸,則會很大程度上增強肽段的抗氧化活性[20]。在經過鑒定序列的3條肽段中,都存在這樣的疏水性氨基酸,這可能是其具有抗氧化活性的原因之一。

要因地制宜，嫁接本地資源稟賦。廣袤農村，自然條件、資源稟賦、經濟基礎等不同，解決方案各異。學習典型，絕不能簡單復制粘貼，流于表面。如果機械照搬，會導致水土不服。比如財力吃緊的地區可通過多元化渠道籌措資金，投工投勞，補上資金缺口。再如人才不足的地區，可主動尋求與高等院校合作，借力“外腦”發揮人才支撐作用。典型經驗不是萬能鑰匙，應立足實際，一把鑰匙開一把鎖。

圖4 合成肽的抗氧化性能圖Fig.4 Antioxidant performance of synthetic peptides

2.6 分子對接

對接結果如圖5所示,生物體內的抗氧化能力多為具有抗氧化能力的小分子化合物與SOD結合后發揮作用,為明確活性肽的抗氧化能力,采用分子對接的方法,將SOD分別與DHDGPDHW、FPPDVGD、PFGDTH進行分子對接。

a-DHDGPDHW;b-FPPDVGD;c-PFGDTH

DHDGPDHW與SOD的Gln147、Ser75、Asn188形成氫鍵,氫鍵的長度分別為2.93、3.17、2.94 ?;與Cys196、Ile153、Ile72、His71、Ile76、Pro5、Glu191、Ala195、Arg192具有疏水作用,結合能為-6.3 kcal/mol。FPPDVGD與SOD的Gly148、Arg192形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.13、2.89、3.14、2.92 ?;與Trp78、Pro8、Ser75、Ile76、Ile72、Gln147、Pro154、Ile153、Ala195、Pro5、Thr79具有疏水作用,結合能為-6.6 kcal/mol。PFGDTH與SOD的His30、His163形成氫鍵,氫鍵的長度分別為2.98、3.03、3.03、3.47、3.10 ?;與Lys29、Leu25、Glu162、Tyr34、Ala33、Phe66具有疏水作用,結合能為-6.2 kcal/mol。由此可見,FPPDVGD與SOD的預測結合能最強,猜測FPPDVGD與SOD結合能發揮其抗氧化能力,這也表明抗氧化肽的強抗氧化活性不僅與分子質量和組成其的氨基酸有關,也可能是肽鏈自身內部氨基酸間或者是兩條肽鏈間的相互作用組成了某個抗氧化位點[21]。

3 結論

本實驗通過測定金華火腿粗肽液的抗氧化能力,對抗氧化肽的抗氧化穩定性進行分析,結果表明在60 ℃,6% NaCl,pH值為7條件下,多肽的抗氧化能力最好。利用凝膠層析色譜對粗肽液進行分離提純,經過nano-HPLC-MS/MS質譜鑒定,得到氨基酸序列分別為:DHDGPDHW、FPPDVGD、PFGDTH。對肽的序列進行合成,測試合成肽的抗氧化性,對選取的3條肽段與SOD進行分子對接,表明抗氧化肽的強抗氧化活性不僅僅與組成的氨基酸和分子質量有關,也可能是肽段酰胺鍵之間相互作用形成某種抗氧化位點,共同作用下,增強了對自由基的清除作用。同時,本研究也表明干腌金華火腿產品含有豐富的抗氧化性的活性肽,對人類健康有益,并對活性肽的抗氧化性機制作出一定的解釋,也為干腌制品的開發研究提供了一定的理論依據。