天然葡萄酒酵母菌種的分離、鑒定和釀造性能評價*

李慧，王惠玲，吳雅琨，黃衛東

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

天然葡萄酒酵母菌種的分離、鑒定和釀造性能評價*

李慧，王惠玲，吳雅琨，黃衛東

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

從“北紅”葡萄汁的自然發酵液中分離天然葡萄酒酵母，利用WL營養瓊脂培養基對分離菌株進行分類鑒定，共分離到7種類型的葡萄酒酵母，其中1株具有典型的釀酒酵母特征。對該株酵母進行進一步的顯微形態觀察、生理生化試驗及DNA序列分析，證明為釀酒酵母。利用模擬葡萄汁模擬標準葡萄汁的成分，以2株商業葡萄酒酵母為參照，研究分離釀酒酵母的釀造特性，研究結果顯示，分離菌株具有良好的酒精轉化性能，較快的酒精發酵速率及甘油產生能力。對模擬葡萄汁進行改良以研究分離菌株的脅迫耐受性，研究結果表明，改良模擬葡萄汁適于葡萄酒酵母單一抗逆性能的研究，分離菌株具有良好的溫度(特別是高溫)、酒精、滲透壓和低pH耐受性。天然葡萄汁對分離菌株釀造性能的檢測結果進一步證明該菌株良好的釀造特性。

WL營養瓊脂培養基，模擬葡萄汁，改良模擬葡萄汁，天然葡萄酒釀酒酵母，釀造性能

葡萄酒的風格不僅與葡萄品種和釀造工藝密切相關，酵母等微生物的發酵作用也非常顯著。因此，雖然有商業葡萄酒酵母可供使用，但一些葡萄酒生產商更傾向于選育葡萄產區酵母來生產具有產區特色的葡萄酒［1－2］。產區酵母已經適應了本地的微環境，易于在葡萄酒發酵中占主導地位，更重要的是，使用產區酵母釀造葡萄酒可以保證產區的典型特色［3］。

中國葡萄酒的工業化雖持續約100多年，但為保證發酵速率和發酵產品的一致性并避免污染，大多數國內葡萄酒生產商都使用進口活性干酵母。而我國葡萄栽培面積廣闊，葡萄適栽區的生態地理環境多種多樣，蘊藏著豐富的葡萄釀酒微生物資源。這些微生物資源長期被擱置，因此分離收集優質葡萄酒產區酵母，利用合理的葡萄酒酵母培養體系對酵母釀造性能進行評價，對本土酵母菌種的選育和生產高品質的“特色”、“產區”葡萄酒非常必要和迫切。

本研究從“北紅”葡萄汁的自然發酵液中分離出天然葡萄酒酵母，利用WL營養瓊脂培養基對分離菌株進行了分類鑒定，并采用模擬葡萄汁及在此基礎上改良的模擬葡萄汁對分離菌株進行釀造性能研究，克服了使用天然葡萄汁進行酵母釀造性能研究的不足，探索了一套適于分離、鑒定及評價葡萄酒酵母的系統。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料及試驗菌種

1.1.1 釀酒葡萄原料

中科院植物研究所(北京)葡萄園采摘成熟的紅葡萄酒釀造品種——“北紅”(Muscat hamburg×V.amurensis)葡萄果實;河北懷來葡萄園采摘成熟的“赤霞珠”葡萄果實(Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon)。

1.1.2 試驗菌種

釀酒酵母BH8(Saccharomyces cerevisia)，本實驗室分離并保存;商業葡萄酒酵母AWRI R2和Freddo，分別由Marivin(Australian)及 Erbsl?h(Germany) 公司商業化，因具有良好的發酵性能而被國內的一些葡萄酒廠使用。為方便說明，分別將酵母AWRI R2，Freddo和BH8重新編號為A、F和B。

1.2 葡萄汁

1.2.1 天然葡萄汁

“北紅”及“赤霞珠”葡萄經除梗、破碎后添加0.03g/L的果膠酶和100 mg/L的SO2，混合均勻后備用。

1.2.2 模擬葡萄汁 (model synthetic medium，MSM)

MSM培養基可以模擬標準葡萄汁的成分，適于研究葡萄酒酵母的釀造特性［4－5］。模擬葡萄汁的成分為(g/L):葡萄糖 (100)，果糖 (100)，酒石酸(3)，檸檬酸 (0.3)，L－蘋果酸 (0.3)，KH2PO4(2)，MgSO4·7H2O(0.2)。氮源 (190 mg total N/L):(NH4)2SO4(0.3 g)，Asn(0.6 g)。無機鹽 (mg/L):MnSO4·H2O(4)，ZnSO4·7H2O(4)，CuSO4·5H2O (1)， KI(1)， CoCl2· 6H2O (0.4)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(1)，H3BO3(1)。維生素(mg/L):肌醇 (300)，生物素 (0.04)，硫酸銨 (1)，吡哆醇(1)，煙酸 (1)，泛酸(1)。脂肪酸 (mg/L):棕櫚酸 (1)，棕櫚烯酸 (0.2)，硬脂酸 (3)，油酸(0.5)，亞油酸 (0.5)，亞麻酸 (0.2)。脂肪酸混合物用Tween 80及100%的乙醇溶解，pH值調整為3.3。

1.3 培養基

(1)YPD固體培養基(g/L):酵母粉(10)，蛋白胨(20)，葡萄糖(20)，瓊脂(20)。

(2)葡萄酒酵母WL鑒別培養基(g/L):酵母粉(4.0)，胰蛋白胨 (5.0)，葡 萄糖 (50)，KH2PO4(0.55)，KCl(0.425)，CaCl2(0.125)，MgSO4(0.125)，FeCl3(0.002 5)，MnSO4(0.002 5)，瓊脂(20)，溴甲酚綠(0.022)。

(3)改良模擬葡萄汁:改良模擬葡萄汁的成分與模擬葡萄汁的成分基本相同，但葡萄糖及果糖的濃度分別調整為10g/L，pH值調整為5.8。

1.4 試驗方法

1.4.1 天然葡萄酒酵母的分離、純化與鑒定

1.4.1.1 葡萄酒自然發酵

將采集的用以分離酵母的葡萄樣品(“北紅”葡萄)除梗、破碎，添加果膠酶。取混勻后的400mL葡萄汁分裝入滅菌的500mL三角瓶中，25℃自然發酵。發酵工藝采用紅葡萄酒的發酵工藝，不添加商業酵母及SO2。期間取樣用于分離酵母，取樣重復2次。

1.4.1.2 天然葡萄酒酵母的分離與純化

葡萄酒自然發酵過程中取樣，將樣品梯度稀釋后涂布于YPD平板以分離酵母，28℃恒溫箱中培養3 d，結合鏡檢和菌落的形態觀察，從平板上挑取分離良好、具有典型性的單菌落，經進一步純化后轉管低溫保存。

1.4.1.3 天然葡萄酒酵母的菌種鑒定

將分離純化的酵母菌種梯度稀釋后涂布于WL平板，25℃培養5～7 d，觀察菌落顏色和形態。挑取具有典型釀酒酵母形態特征的菌株，送中科院微生物研究所進行酵母生理和分子生物學鑒定。

1.4.2 葡萄酒釀造試驗

所有的釀造試驗使用紅葡萄酒的釀造工藝，試驗進行3次，使用滅菌的三角瓶，靜止培養，活化菌種接種量為0.5%，25℃培養。三角瓶體積/葡萄汁的體積為5/4，使用棉塞或添加有濃H2SO4的發酵栓封口。

1.4.3 葡萄酒酵母細胞培養試驗

酵母細胞培養試驗進行3次，使用滅菌的三角瓶搖床培養，培養基為改良模擬葡萄汁，接種量為0.5%，三角瓶體積/培養基體積為5/1，培養條件為28℃、160 r/min。每2 h取樣1次，利用分光光度計在600 nm波長下測定菌液的吸光度并結合酵母細胞活性分析以繪制酵母生長曲線。

1.4.4 葡萄酒酵母脅迫耐受性能試驗

1.4.4.1 溫度(高溫)耐受性能試驗

活化菌種轉接于改良模擬葡萄汁中，接種量為1%。分別在22、28、37、40及44℃下三角瓶搖床培養24 h，每3 h取樣1次，利用分光光度計在600 nm測定菌液的吸光度以繪制酵母生長曲線。

1.4.4.2 酒精耐受性能試驗

活化菌種轉接于酒精濃度調整為4%、8%、10%和12%的改良模擬葡萄汁中，接種量為1%，28℃培養24 h，每3 h取樣1次，利用分光光度計在600 nm波長下測定菌液的吸光度以繪制酵母生長曲線，以不添加酒精的為對照。

1.4.4.3 滲透壓耐受性能試驗

酵母滲透壓試驗經常使用NaCl和山梨醇作為滲透壓處理劑［6－7］。為避免離子傷害，本試驗選用非離子的，不被酵母代謝利用的山梨醇作為滲透壓脅迫處理劑。1mol/L山梨醇添加到含20g/L糖的培養基中所引起的滲透壓相當于200g/L糖引起的滲透壓［8－9］。

活化菌種轉接于含 1.0、1.5、1.7 及 2.0mol/L山梨醇的改良模擬葡萄汁，接種量為1%，28℃培養24 h，每3 h取樣1次，以不添加山梨醇的為對照，利用分光光度計在600 nm波長下測定菌液的吸光度以繪制酵母生長曲線。

1.4.4.4 pH 耐受性能試驗

用5mol/L H2SO4或5mol/L NaOH將改良模擬葡萄汁的 pH 值調整為 2.8、3.0、3.3、5.8 及 8.0，活化好的菌種分別轉接于上述培養基中，接種量為1%，28℃培養24 h，每3 h取樣1次，測定600 nm下菌液的吸光度以繪制酵母生長曲線。

以上所有試驗，各處理重復次數均為3次。

1.5 分析方法

1.5.1 細胞生長測定

測定菌液的OD600nm值或菌液梯度稀釋后涂布于YPD平板，28℃培養72 h后計算活菌落數。

1.5.2 葡萄糖、果糖、乙醇、甘油的檢測及CO2失重的測定

1.5.2.1 葡萄糖、果糖、乙醇、甘油的檢測

按Liu等［10］的方法，使用高效液相色譜儀 (Waters 2695，Milford，MA，USA)，色譜柱為 Aminex HPX－87H(300 mm ×7.8 mm)(Bio－Rad;USA)。柱溫65℃;流動相為0.005mol/L H2SO4，流速為0.600mL/min。檢測器為示差檢測器;進樣量20μL。

1.5.2.2 CO2失重的測定

接種前、接種后及發酵過程中，用電子天平稱重(精確到0.01 g)發酵瓶，稱前先搖晃瓶子，以排除CO2。

1.5.4 總酸的測定

按國標GB/T 15038－2006指示劑法進行。

1.6 數據分析

所有的試驗進行 3次，使用 SPSS11.0(SPSS Inc.Chicago，IL)軟件進行數據分析。S－N－K(NEWMAN Keuls)單因素方差分析比較平均值。差異顯著性設為 P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 天然葡萄酒酵母的分離

從“北紅”的自然發酵液中分離的酵母在WL培養基上可形成7種不同的菌落形態。參照Cavazza等［11］詳細描述的葡萄酒相關酵母在WL營養瓊脂上的菌落特征，其中BH8的菌落特征與釀酒酵母相符，在WL培養基上為奶油色帶綠色，球形突起，表面光滑，不透明。顯微形態觀察顯示，細胞形狀為圓形、橢圓形、出芽生殖，呈典型的酵母形態。該組酵母經中科院微生物所進一步進行生理生化試驗及核糖體ITS區的克隆和測序，也證明為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。

2.2 分離釀酒酵母菌株在模擬葡萄汁中的釀造性能

2.2.1 分離釀酒酵母菌株酒精轉化能力及酒精發酵速率

模擬葡萄汁中，酵母還原糖的消耗、乙醇的產量、酵母細胞的生長及CO2的失重如圖1所示。

圖1 菌株A、B和F在模擬葡萄汁發酵過程中糖消耗、乙醇產生(a)及CO2失重、酵母生長的動態曲線(b)

從圖1可以看出，與2株參照商業葡萄酒酵母菌株A和F相比，分離菌株B顯示了良好的乙醇轉化能力、乙醇轉化速率和生長特征。發酵到第2天，酵母開始進入穩定期，細胞數增殖到2.0×108CFU/mL［圖1(b)］，此時，糖消耗速率和乙醇生成速率加快［圖1(a)］，CO2失重值最大［圖1(b)］。發酵至第6天時，培養基中的糖降至0.5%以下，乙醇含量達到11%以上，發酵至第7天時，發酵基本結束，最終產生的乙醇濃度為11.01%(A)，11.02%(B)及11.03%(F)。

2.2.2 分離釀酒酵母菌株產甘油的能力

在模擬葡萄汁發酵過程中，分離菌株B與2株商業菌株A和F甘油的產量如圖2所示。

圖2 菌株A、B和F在模擬葡萄汁發酵過程中甘油的產生

從圖2可以看出，甘油的產量在發酵前2天增加迅速，隨后逐漸增加，發酵結束時，發酵液中甘油的含量分別達到5.28g/L(A)，5.51g/L(B)和5.17g/L(F)，與2株商業酵母菌株相比，菌株B顯示了良好的甘油生產能力。甘油不僅是酵母重要的抗逆應答代謝產物，而且是一種重要的風味化合物，葡萄酒中的甘油具有甜味，可增加葡萄酒的圓潤感和豐厚感［12］。酵母產甘油的能力也是葡萄酒酵母菌種選育的重要指標。

2.3 改良模擬葡萄汁對葡萄酒釀酒酵母抗逆性能的測定

葡萄酒釀造過程中，要求具有耐溫度變化、耐高滲透壓、耐酒精、耐低pH等抗逆性能［13］，它是葡萄酒酵母菌種選育的重要指標。

2.3.1 改良模擬葡萄汁對葡萄酒釀酒酵母生長的影響

使用MSM研究葡萄酒酵母的釀造性能，具有使用方便、結果重復性好的優點。但是，作為可被酵母代謝利用的碳源，MSM中的糖濃度(200g/L)將不斷減少，同時培養基中的乙醇濃度將不斷增加，加上培養基中較低的pH值(pH 3.3)等各種因素的影響，用該培養基研究酵母的抗逆性能，通常是多種脅迫因素對酵母的影響。參照培養酵母常用的YPD培養基，本研究將MSM中還原糖的含量調整為20g/L，pH值調整為5.8。首先檢測改良模擬葡萄汁對葡萄酒酵母生長的影響(圖3)。

圖3 菌株A、B和F在YPD培養基(a)和改良模擬葡萄汁(b)中的生長情況

從圖3可以看出，在相同接種量、相同培養條件下，分離菌株B和商業菌株A、菌株F在改良模擬葡萄汁中都能生長良好。與在YPD培養基中的生長相比，雖然3株酵母的遲滯期大約延長了1 h，但對數期和穩定期都比較長，并沒有受到顯著影響;用改良模擬葡萄汁培養3株酵母至穩定期時，酵母細胞數也都分別達到2.0×108CFU/mL以上。因此，改良模擬葡萄汁也適合葡萄酒酵母的生長，可用于培養葡萄酒酵母。

2.3.2 分離酵母菌株的溫度(高溫)耐受性分析

不同培養溫度(22、28、37、40 及 44℃)下，分離酵母菌株B及菌株A、菌株F在改良模擬葡萄汁中的生長曲線如圖4所示。

圖4 不同培養溫度下，菌株A、B和F在改良模擬葡萄汁中的生長 (n=3，sd＜16%)

從圖4可以看出，分離菌株B與菌株A、菌株F一樣可以在較寬的溫度(高溫)范圍內生長。28℃是酵母的適宜生長溫度，22℃或37℃對該酵母生長的影響比較小，只有當培養溫度升高至40℃時，細胞的對數期才明顯延長，培養24 h后，細胞的生物量僅為28℃培養溫度下的30%(OD600的比值)左右。而在44℃的培養溫度條件下，酵母的生長停滯，細胞長久的處于遲滯期。

2.3.3 分離酵母菌株的乙醇耐受性分析

培養基中添加了4%、8%、10%及12%的乙醇后，酵母的生長曲線如圖5所示。

從圖5可以看出，3株酵母都可以在含4%～10%乙醇的培養基中生長，表現出良好的乙醇耐受性。但隨著乙醇體積分數的增加，細胞的生物量明顯降低。當培養基中乙醇體積分數為8%和10%時，細胞的對數期明顯延長，且10%的乙醇影響更為明顯，培養24 h后，細胞的生物量僅為對照的30%(OD600的比值)左右。在含12%乙醇的培養基中，3株酵母的生長都基本停滯。

圖5 菌株A、B和F在含不同濃度乙醇的改良模擬葡萄汁中的生長 (n=3，sd＜16%)

2.3.4 分離酵母菌株的滲透壓耐受性分析

從酵母在含不同濃度山梨醇的培養基中的生長曲線(圖6)可以看出，與商業酵母菌株A和F對比，菌株B也表現出較好的滲透壓耐受性。雖然1.5mol/L的山梨醇已經明顯抑制了酵母的生長，但即使繼續增加山梨醇的濃度至2.0mol/L，培養24 h后，細胞的生物量仍能達到對照的50%(OD600的比值)左右。

圖6 菌株A、B和F在含不同濃度山梨醇的改良模擬葡萄汁中的生長 (n=3，sd＜16%)

2.3.5 分離酵母菌株的低pH值耐受性分析

不同pH值對酵母生長的影響如圖7所示。從圖7可以看出，與菌株F和菌株B相比，商業菌株A顯示了更寬的pH耐受范圍，但實驗室新分離的菌株B和商業菌株F也能在較低的pH培養條件下生長。pH值調整為3.3時對酵母生長的影響比較小，當培養基的pH值調整為3.0時，細胞的遲滯期和對數期都有所延長，當pH值為2.8時，3株酵母都停滯生長，細胞長久的處于遲滯期。

圖7 菌株A、B和F在不同pH值的改良模擬葡萄汁中的生長 (n=3，sd＜16%)

試驗結果顯示，改良模擬葡萄汁可用于葡萄酒酵母單一脅迫耐受性能的研究。分離菌種具有良好的溫度(高溫)、酒精、滲透壓及低pH值耐受性能。

2.4 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中發酵性能的比較

進一步研究分離菌株在天然葡萄汁中的乙醇轉化性能。所使用的釀造原料為分離該菌株的“北紅”葡萄，及采自河北懷來葡萄園的“赤霞珠”葡萄。

2.4.1 葡萄汁基本成分分析

“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中糖、酸含量及pH值如表1所示。

表1 “北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁成分分析 (n=3，sd＜12%)

2.4.2 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中的乙醇轉化能力

還原糖的消耗，乙醇的產量如圖8所示。

圖8 菌株A、B和F在“北紅”葡萄汁 (a)和“赤霞珠”(b)葡萄汁發酵過程中糖的消耗及乙醇的產生

從圖8可以看出，分離菌株B及菌株A和F在天然葡萄汁中都表現出了良好的乙醇轉化能力和較快的乙醇轉化速率。在葡萄汁中的發酵周期僅為4 d。發酵結束時產生乙醇的濃度，“北紅”葡萄汁為11.63%(A)，11.72%(B)及 11.58%(F);“赤霞珠”葡萄汁為 12.03%(A)，11.84%(B)及 11.82%(F)。

2.4.3 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中的甘油生成能力

“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁發酵過程中，分離菌株及2株商業菌株甘油的產量如圖9所示。

圖9 菌株A、B和F在“北紅”葡萄汁 (a)和“赤霞珠”(b)葡萄汁發酵過程中甘油的產生

從圖9可以看出，3株酵母在2種葡萄汁中發酵，都能產生大量的甘油，含量高于6g/L。分離菌株顯示了更好的甘油生成能力，尤其使用“北紅”葡萄汁發酵，產生更多的甘油。

3 討論

WL營養瓊脂被設計用于飲料發酵過程中微生物類群的監測。Cavazza 等［11］和 Pallmann 等［14］的研究表明，在葡萄酒自然發酵過程中出現大多數典型的酵母菌種都可以用WL營養瓊脂培養基進行區分，主要基于菌落顏色和菌落形態。雖然該方法對于酵母菌種鑒定的準確度無法與測序相比，但對于不需要非常準確的分類試驗和數量較大的菌種鑒定工作來說，WL營養瓊脂是相當簡便、快速并且也是十分有效和節儉的方法。本研究利用WL營養瓊脂培養基對從“北紅”葡萄汁的自然發酵液中分離的天然葡萄酒酵母進行分類鑒定，共分離到7種類型的葡萄酒酵母，其中一株具有典型的釀酒酵母特征。進一步通過顯微形態觀察、生理生化試驗及DNA序列分析也證明該酵母為釀酒酵母。

由于天然葡萄汁的供應具有季節性限制，葡萄栽培產區、葡萄栽培品種等原因引起的葡萄汁成分的差異，使對選育葡萄酒酵母菌種釀造性能的評價難以長期、有效、一致的進行。因此，國外的研究人員［4－5］使用模擬葡萄汁(MSM)。MSM既可以模擬標準葡萄汁的成分，減少天然葡萄汁中的固態成分對分離酵母細胞的影響，還具有使用方便、結果重復性好的優點。更重要的是MSM是完全化學合成的培養基，可以方便的進行成分調整。但是，MSM不適于研究葡萄酒酵母的單一脅迫耐受性能，所以本研究將MSM進行改良。改良后的MSM適于葡萄酒酵母的生長并適于研究葡萄酒酵母的單一脅迫耐受性。采用模擬葡萄汁、改良模擬葡萄汁對實驗室新分離葡萄酒釀酒酵母的釀造特性進行評價，分離菌種顯示了良好的乙醇轉化性能;較快的乙醇發酵速率及甘油產生能力;較好的溫度(特別是高溫)、乙醇、滲透壓及低pH值耐受性能。天然葡萄汁對該菌株釀造性能的研究進一步支持上述結論。

本研究首先分離天然葡萄酒酵母，并對葡萄酒酵母菌種簡便、快速的分離和鑒定方法進行探索，進一步利用葡萄酒酵母的實驗室培養體系研究分離菌株的釀造特性，為研究本土葡萄釀酒微生物資源的生物多樣性，分離收集優質葡萄酒產區酵母菌株，推動產區葡萄酒的發展奠定基礎。

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Study on the Isolation，Identification of Native Wine Yeast and the Evaluation of Its Oenological Characteristics

Li Hui，Wang Hui－ling，Wu Ya－kun，Huang Wei－dong
(College of Food Science ＆ Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Native wine yeasts isolated from spontaneously fermenting Beihong red wine grape(Muscat Hamburg×V.amurensis)were plated onto Wallerstein Laboratory Nutrient Agar(WL).Seven unique colony morphologies were identified and one strain showed distinct character of Saccharomyces cerevisia.Further identification by micro－morphological observation，physiological and biochemical experiment and DNA sequence analysis also confirmed the strain as S.cerevisia.The model synthetic medium which could simulate a standard grape juice was used to study the important enological traits of the newly selected S.cerevisia，the results showed that the newly selected S.cerevisia had high ethanol production，high fermentation activity and high glycerol production.The model synthetic medium was modified to study the stress tolerance of the newly selected S.cerevisia，the result showed that the modified model synthetic medium could be used for analyzing single stress tolerance of wine yeast，the newly selected wine yeast could tolerant high temperature，high ethanol concentration，high sorbitol concentration and low pH.Pilot scale fermentation using nature grape juice also showed that the newly selected S.cerevisia had desirable fermentative behavior.

WL medium，model synthetic medium，modified model synthetic medium，native wine yeast，oenological characteristics

博士研究生(黃衛東教授為通訊作者)。

*北京科委重大項目(D07060500160701)

2010－04－21，改回日期:2010－09－07