覆盆子藥材質量標準研究*

★ 郭卿 付輝政 周國平 楊毅生 鐘瑞建

(1.江西省食品藥品檢驗所，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心 江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學 江西 南昌 330004)

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實，別名種田泡、樹莓、牛奶母、大號角公，主要分布于浙江、江西、安徽及貴州等地。具有補腎、固精、明目之功效，用于腎虛遺尿、小便頻數、陽痿早泄、遺精漏精等癥的治療[1,2]。覆盆子所含化學成分較復雜，迄今已報道的從覆盆子果實和葉中分離得到的化學成分包括酚酸類、黃酮類、生物堿類、甾醇類、萜類、香豆素類、長鏈脂肪族類、有機酸等[3]。

覆盆子為《中國藥典》2010版一部收載品種，標準中僅有性狀和粉末鑒別，為了更好地控制覆盆子藥材的質量，筆者對覆盆子70%乙醇提物化學成分進行了系統的研究，從覆盆子藥材中分離鑒定了10個成分，其中鞣花酸、椴樹苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷為覆盆子中的主要特征成分[4-6]。覆盆子為2015版《中國藥典》一部起草品種，基于前期對覆盆子化學成分研究基礎，對不同產地的10批覆盆子藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進行了研究、采用薄層色譜法及HPLC法進行了定性、定量研究。為覆盆子的質量標準提高奠定了基礎。

1 儀器與試藥

島津LC 2010高效液相色譜：四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外可變波長檢測器，SHIMADZU Lcsolution色譜工作站。BS110S十萬分之一天平(Sartoris )。電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫療器械廠)。乙腈為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，其他試劑均為分析純。

鞣花酸對照品、椴樹苷對照品、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品為本實驗室自制，通過1H-NMR、13C-NMR、MS等確證了它們的結構，純度經HPLC檢測大于98%。

覆盆子藥材10批為本課題組收集，由江西省食品藥品檢驗所袁桂平中藥師鑒定為覆盆子(RubuschingiiHu)，標本存于江西省食品藥品檢驗所科研室。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 鞣花酸薄層色譜鑒別

取2.3.3項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取鞣花酸對照品，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上對照品溶液2μL，供試品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層析上，以氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，見圖1。

1.為鞣花酸對照品；2.3.4.為供試品

2.1.2 椴樹苷薄層色譜鑒別

《結婚十年》是蘇青最具代表性的一部帶有自傳體性質的長篇小說。書中主要描寫了女主人公蘇懷青與丈夫徐崇賢十年以來的平淡而又辛酸的婚姻生活，揭示了一個渴望追求新生活的都市女性，在新舊思想交替的戰爭年代與男權壓抑之下的漫長而又曲折的心路歷程。

取2.3.3項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取椴樹苷對照品，加甲醇分別制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上對照品溶液2μL，供試品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層析上，以乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(90∶4∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105℃加熱5min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖2。

1.為椴樹苷對照品；2.3.4.為供試品

2.2 水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的測定 水分測定按《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H第一法水分測定法中的第一法烘干法測定；總灰分、酸不溶性灰分測定按《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K灰分測定法；水溶性浸出物按《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅹ A項下的熱浸法測定[7]。10批藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的測定結果見表1。

表1 覆盆子藥材中水分、灰分及浸出物測定結果(%)

2.3 山柰酚-3-O-蕓香糖苷的HPLC含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Welch C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相∶乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；流速:1.0mL/min；檢測波長:344nm；柱溫:30℃；進樣量:10μL。在上述色譜條件下，覆盆子中山柰酚-3-O-蕓香糖苷與其他組分的色譜峰分離度良好。色譜圖見圖3。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，加甲醇制成1mL含80μg的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25mL，蒸干，殘渣加水20mL使溶解，用石油醚提取3次，每次20mL，棄去石油醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖3 山柰酚-3-O-蕓香糖苷(A)和覆盆子藥材(B)的HPLC圖

2.3.4 線性關系的考察 取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，分別置50mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，得山柰酚-3-O-蕓香糖苷(0.0789mg/mL)的對照品溶液，分別吸取1，2，4，6，8，10，20μL，按上述色譜條件測定峰面積。以山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品進樣量C(μg)為橫坐標，相應色譜峰面積積分值A為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為A=1×106C-9996(r=0.9999)。山柰酚-3-O-蕓香糖苷在0.0789～1.1835μg之間成良好的線性。

2.3.6 重現性試驗 取同一批覆盆子粉末(過4號篩)6份，每份約1.0g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的平均含量為0.775mg/g，RSD為1.6%，表明該方法有良好的重現性。

2.3.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，測得山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD(n=6)為1.36%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.8 回收率試驗 采用加樣回收法，取已知含量的覆盆子藥材粉末(過4號篩)6份，每份約0.5g，每份精密加入含山柰酚-3-O-蕓香糖苷(0.0078 mg/mL)的對照品溶液50mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，計算回收率。結果山柰酚-3-O-蕓香糖苷的平均回收率(n=6)為101.9%，RSD為0.7%。

2.3.9 耐用性試驗 取同一批覆盆子藥材粉末(過4號篩)約1.0 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別用A：Welch C18(250 mm×4.6mm，5μm)、B：Promosi C18(250mm×4.6mm，5μm)、C：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)三種品牌的色譜柱按正文中的色譜條件對其進行測定，結果無明顯差別。

2.3.10 樣品測定 分別取不同產地的10批覆盆子藥材，每個樣品取3份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10μL，在上述色譜條件下進樣分析，測定峰面積，用外標法計算出山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量，測定結果見表2。

表2 覆盆子中山柰酚-3-O-蕓香糖苷的測定結果(n=3)

3 討論

3.1 TLC鑒別 在鞣花酸薄層色譜鑒別中，通過對比不同比例的氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5；5∶1∶1)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(4∶1∶1.5；5∶1∶1)等不同展開劑，結果表明氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5)系統能展開清晰斑點且能完全分開。在椴樹苷薄層色譜鑒別中，通過比較不同比例的正丁醇∶甲醇∶水∶甲酸(80∶5∶5∶0.5；90∶4∶4∶0.5)和乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(80∶5∶5∶0.5；90∶4∶4∶0.5)等不同展開劑，結果表明乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(90∶4∶4∶0.5)展開椴樹苷，斑點清晰且能完全分開，重復性好。

3.2 測定波長的選擇 取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，用甲醇制成適當的濃度，以甲醇為空白，在400～200nm波長范圍內進行光譜掃描，結果山柰酚-3-O-蕓香糖苷在263和350nm波長處有最大吸收，由于344nm雜峰對目標峰干擾少且穩定，故選擇344nm作為檢測波長。

3.3 提取方法的選擇 比較了甲醇加熱回流提取，甲醇超聲提取2種提取法。結果表明加熱回流提取法提取效率大于超聲提取法。實驗過程中比較了提取時間(30，60，90min)和甲醇濃度(30%，50%，70%，90%，100%)，結果表明提取60min可將山柰酚-3-O-蕓香糖苷完全提取，甲醇濃度為70%時，提取效率稍高于其他比例。

3.4 石油醚和水飽和正丁醇萃取次數的選擇 對其石油醚萃取次數進行了考察，結果用石油醚提取不能將山柰酚-3-O-蕓香糖苷提取出來，當用石油醚提取3次后，石油醚提取液蒸干后，基本沒有內容物，故選擇用石油醚提取3次。對其水飽和正丁醇提取次數進行了考察，結果用水飽和正丁醇提取第4次時已提取完畢，故選擇用水飽和正丁醇提取3次。

3.5 色譜條件的優化 本實驗通過摸索乙腈與磷酸水溶液，甲醇與磷酸水溶液按一定比例混合作為流動相，考察其分離度，結果以乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)為流動相，流速1.0mL/min，柱溫30℃的色譜條件下藥材中山柰酚-3-O-蕓香糖苷與其他共存組分峰能達到良好的分離。

本實驗建立了覆盆子藥材中山柰酚-3-O-蕓香糖苷的HPLC含量測定方法，并對其進行了TLC定性鑒別及水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物檢測，該方法操作簡便、結果可靠、重復性好。

[1]江西省衛生廳.江西省中藥材標準(1996年版)[M].南昌：江西科學技術出版社，1996：130-131.

[2]江蘇新醫學院.中藥大辭典(1977年版)[M].上海：上海人民出版社，1977:1 261.

[3]程丹,李潔,周斌,鄭鵬武.覆盆子化學成分與藥理作用研究進展[J].中藥材,2012,35(11):1 873-1 876.

[4]柴偉,王祝舉,唐力英,等.HPLC測定覆盆子中椴樹苷的含量[J].中國中藥雜志,2009,34(19):2 534-2 535.

[5]孫萍,李艷,楊秀菊.覆盆子果總黃酮的微波提取及含量測定[J].數理醫藥學雜志,2003,16(1):85-86.

[6]程麗珍,張玲,謝曉梅.超高效液相色譜法同時測定覆盆子中3種黃酮成分的含量[J].安徽中醫學院學報,2012,31(5):75-77.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社,2010.