核桃油微量組分對其氧化穩定性的影響*

朱振寶，劉夢穎，易建華

1(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021)

2(陜西省食品加工工程技術研究中心，陜西西安710021)

植物油的氧化穩定性是衡量植物油質量的重要指標。植物油氧化酸敗會產生大量自由基、氫過氧化物以及醛、酮等物質，從而破壞油脂營養價值，影響其感官品質及貨架期。長期攝入劣變的油脂會導致身體機能衰退、影響肌肉活力、甚至具有潛在的致癌性［1］。研究表明，植物油的氧化穩定性不僅受溫度、光照、氧氣含量等多種貯存環境因素影響，而且油脂自身的脂肪酸組成、微量成分含量等也與其氧化穩定性密切相關。

植物油含有多種不同種類的微量組分，在植物油氧化初級階段，會生成以共軛雙烯和共軛三烯為主的共軛烯烴類物質，因此，共軛烯烴值可以用來表示油脂初級氧化程度，是初級氧化產物的指標［2］。氫過氧化物是油脂氧化過程的中間產物，且多數情況下不穩定，會繼續分解為次級氧化產物，如醛、酮等羰基化合物，因此，羰基值可以表示油脂次級氧化程度，也是油脂氧化變化的良好指標［3］。除共軛烯烴和羰基化合物以外，植物油中還有許多其他微量組分，它們不但具有營養價值，還有一定的抗氧化作用。Jierong等人［4］的研究表明，棕櫚油中的類胡蘿卜素具有抗氧化作用，且和生育酚之間存在良好的抗氧化協同作用。多酚化合物及生育酚也已被證明是天然存在于油脂中的微量成分并具有良好的抗氧化效果［5-6］。Jiyeun等人［7］還發現，菜籽油中的磷脂可以抑制單線態氧引起的α-生育酚的降解，從而提高油脂本身的抗氧化性。此外，Jana等［8］的研究表明，油脂中黃酮類物質能抑制油脂與氧的反應從而也能起到抗氧化的作用。

由于核桃油脂不飽和脂肪酸含量很高，而且亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸是核桃油中的主要成分，因此非常容易氧化，已成為影響其營養品質和貨架期的重要問題。盡管現有研究發現生育酚、多酚、黃酮、胡蘿卜素等物質具有良好的抗氧化活性，但在核桃油中這些抗氧化活性物質的含量以及它們對核桃油氧化穩定性的影響尚缺乏深入、系統地研究。此外，關于核桃油體外抗氧化能力與其氧化穩定性之間的相關性也未見報道。因此，本文以核桃油為試材，通過測定核桃油清除DPPH·和ABTS+·的能力，結合β-胡蘿卜素脫色法評價核桃油體外抗氧化能力;并通過分析核桃油中微量組分含量與氧化穩定指數(OSI)的相關性來研究核桃油中微量組分含量對其氧化穩定性的影響。核桃油中的微量組分盡管含量很低，但在其氧化過程中具有重要作用，本研究不僅可以為揭示核桃油氧化穩定性的機理提供理論參考，同時能夠為提高核桃油的營養品質和延長貨架期提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

核桃仁，購于西安本地市場。

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、β-胡蘿卜素、亞油酸、蘆丁、α-生育酚、Folin-Phenol等試劑均購于Sigma公司;其余試劑若無特別說明均為分析純。

1.2 設備儀器

743型 Rancimat油脂氧化測定儀，瑞士萬通Metrohm公司;759S型紫外分光光度計，上海荊和分析儀器有限公司;101-2型電熱鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 油脂提取

核桃油脂的提取均采用溶劑浸提法，其工藝流程為:

核桃仁→去皮→烘干→粉碎→石油醚浸提→抽濾→蒸發脫溶→核桃毛油

1.3.2 DPPH·清除能力的測定［2］

準確稱取20 mg DPPH·，用無水乙醇溶解并定容至250 mL容量瓶中，得濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液。取不同稀釋度油樣與DPPH·溶液加入同一具塞試管中，搖勻，反應30 min后，用無水乙醇作參比，不加油樣的溶液作對照，測定515 nm處溶液的吸光度，根據公式計算清除率。

清除率/%=［1-Ai/Ac］×100

式中:Ai，油樣與DPPH·溶液混合后的吸光度;Ac，對照溶液的吸光度。

1.3.3 ABTS+·清除能力的測定

ABTS+·清除能力測定參照Re等［9］的方法，略作修改。

將ABTS加入到無水乙醇中，利用超聲波輔助溶解，使ABTS濃度為7 mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，避光反應12 h。將生成的ABTS﹢·溶液用無水乙醇稀釋，得到ABTS﹢·工作液［該工作液在734 nm波長下的吸光度為需為(0.70±0.02)］。取不同稀釋度油樣與ABTS﹢·工作液于具塞試管中混合均勻，反應60 min后，在405 nm下測其吸光值，以無水乙醇作參比，不加油樣的溶液作對照，不加ABTS的溶液作空白。根據公式計算清除率。

清除率/% =［1-(As-Ac)/Amax］×100

式中:As，油樣與ABTS工作液混合后的吸光度;Ac，空白溶液的吸光度;Amax，對照溶液的吸光度。

1.3.4 β-胡蘿卜素脫色法測定抗氧化活性

依照黃海蘭等［10］的方法，略作修改。

將5 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL三氯甲烷中，混合均勻后40℃旋轉蒸發除去三氯甲烷，再加入120 mg亞油酸、1.2 g吐溫40以及300 mL丙酮，混合均勻，得到工作液。于具塞試管中加入不同稀釋度的油樣以及4.4 mL工作液，以丙酮做參比，在470 nm下測定其吸光度。之后置于50℃水浴中反應3 h后，依舊于470 nm下測定其吸光度。以不加油樣的溶液作對照，不加β-胡蘿卜素的溶液作空白。根據公式計算抗氧化活性。

式中:Ao，起始時油樣與工作液混合后的吸光度;Ao'，3 h后油樣與工作液混合后的吸光度;At，起始時空白溶液的吸光度;At，3 h后空白溶液的吸光度;Ac，起始時對照溶液的吸光度;Ac'，3 h后對照溶液的吸光度。

1.3.5 OSI測定

取3 g油樣，在溫度120℃、空氣流量15 L/h條件下，利用743型Rancimat油脂氧化測定儀自動評估核桃油脂的OSI。

1.3.6 共軛烯烴含量測定

依照GB/T 22500-2008進行。

1.3.7 羰基化合物含量測定

依照GB/T 5009.37-2003進行。

1.3.8 磷脂含量測定

依照GB/T 5537-2008進行。

1.3.9 生育酚含量測定

精確稱取200 mg油樣于10 mL容量瓶中，加入5 mL三氯甲烷，混合均勻后加入3.5 mL 2，2'-聯吡啶(0.7 mg/mL，體積分數95%乙醇)及0.5 mL FeCl3(2 mg/mL，體積分數95%乙醇)，用體積分數95%乙醇定容至10 mL，靜置1 min后，以不加油樣的試劑做空白，在520 nm處測定吸光值。分別取10 g/L的α-生育酚標準品溶液 10、15、20、25、30、35 μL，按上述方法測定，繪制標準曲線。

1.3.10 總酚含量測定

總酚提取:取一定量的核桃毛油，用甲醇等體積萃取3次，合并萃取液，40℃真空濃縮至近干，用相應溶劑5 mL分別多次洗出于10 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，冷凍脫脂后吸取上層醇相進行測定。

總酚含量測定:取一定體積待測液，加入0.5 mL福林酚試劑，靜置3 min后加入10%Na2CO3溶液1 mL，蒸餾水定容至25 mL，35℃下反應120 min，于725 nm下測定吸光值。分別取1 mg/mL的沒食子酸標準液2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mL，按上述方法測定，繪制標準曲線。

1.3.11 β-胡蘿卜素含量測定

取油樣0.5 g于25mL容量瓶中，用石油醚定容，于450 nm下測定吸光度。分別取10 μg/mL β-胡蘿卜素標準液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 于 25 mL 容量瓶中，按上述方法測定，繪制標準曲線。

1.3.12 黃酮含量測定

精確吸取7 mL核桃油于50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋定容，吸取該溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 mim;再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min;最后加入4%NaOH溶液10 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min后以不加油樣的溶液做空白，于360 nm下測定吸光值。分別取0.2 mg/mL的蘆丁標準液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，按上述方法測定，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 核桃油體外抗氧化活性

通過測定核桃油對DPPH·、ABTS+·的清除能力，并結合β-胡蘿卜素脫色法評價核桃油的體外抗氧化能力，結果如表1所示。利用SPSS軟件分析核桃油體外抗氧化能力與其OSI相關性，結果如表2所示。

表1 核桃油體外抗氧化能力Table 1Antioxidant activities of walnut oil

表2 核桃油體外抗氧化能力與OSI相關性Table 2 Relation between antioxidant activities and OSI of walnut oil

由表1可知，核桃油對DPPH·和ABTS+·具有不同程度的清除能力，半抑制濃度分別為為0.161 g/mL和0.841 g/mL，通過β-胡蘿卜素脫色法得到核桃油體外抗氧化活性的IC50為1.292 g/mL。由表2可知，3種方法測得的核桃油抗氧化能力與其OSI均有良好的相關性，其中核桃油DPPH·清除能力與OSI呈極顯著相關(P＜0.01)，ABTS+·清除能力以及利用β-胡蘿卜素脫色法測得的抗氧化活性與OSI呈顯著相關(P＜0.05)?？梢?，核桃油本身具有一定程度的抗氧化能力，且這種抗氧化能力與其氧化穩定性相關。

2.2 核桃油微量組分與氧化穩定性關系

2.2.1 微量組分標準曲線

總酚、生育酚、黃酮及β-胡蘿卜素含量標準曲線如圖1～圖4所示。

圖1 總酚含量標準曲線Fig.1 The standard curve of total phenolics

圖2 生育酚含量標準曲線Fig.2 The standard curve of total tocopherols

2.2.2 微量組分含量與OSI相關性

圖3 黃酮含量標準曲線Fig.3 The standard curve of flavonoids

圖4 β-胡蘿卜素含量標準曲線Fig.4 The standard curve ofβ-carotene

測定核桃油中共軛烯烴、羰基化合物、總酚、生育酚、黃酮、β-胡蘿卜素及磷脂含量，并利用SPSS軟件分析7種微量組分含量與OSI相關性，結果如表3所示。

表3 核桃油微量組分與OSI相關性Table 3 Relation between micro component content and OSI of walnut oil

由表3可知，核桃油中7種微量組分含量與OSI均有良好的相關性(P＜0.01)，其中共軛烯烴和羰基化合物含量與OSI呈極顯著負相關，這是由于共軛烯烴和羰基化合物是油脂氧化過程中的初級和次級氧化產物，即共軛烯烴和羰基化合物含量越高則油脂氧化程度越深。而總酚、生育酚、黃酮、β-胡蘿卜素和磷脂含量與OSI呈極顯著正相關，說明核桃油中的總酚、生育酚、黃酮、β-胡蘿卜素和磷脂具有一定的抗氧化能力。國外也已有一些相關研究得出類似的結論，Jiyeun等發現，生育酚可以鈍化單線態氧至基態，從而降低光照引起的油脂氧化，且生育酚與胡蘿卜素、磷脂之間均有良好的抗氧化協同作用［7］。Luis等研究橄欖油中酚類物質的抗氧化作用，發現橄欖油的氧化穩定性與其總酚含量高度相關［11］。此外，Jana等人的研究結果表明［8］，黃酮類物質能夠抑制油脂氧化是因為它能夠抑制油脂與氧的反應，從而起到抗氧化作用。同時，Jierong等人［4］的研究表明，類胡蘿卜素可以有效抑制光照引起的魚油氧化，且與生育酚之間有良好的協同作用。Mohamed等人［6］研究了幾種植物油的自由基清除能力，結果表明磷脂具有一定的抗氧化作用，且可以通過乳化作用增加抗氧化劑與油脂的接觸，提高抗氧化效果。由此可見，油脂中的微量成分的確會對油脂的氧化穩定性產生一定影響，但具體抗氧化機理還有待進一步深入研究。

利用回歸分析進一步分析7種微量組分與核桃油OSI的相關程度，結果如表4所示。

表4 核桃油微量組分對OSI影響程度Table 4 Relative contribution of each micro component contents to OSI of walnut oil

通過回歸分析得到的回歸模型P=0.032＜0.05，模型有意義。由于回歸方程各項系數大小表示該自變量對因變量影響程度的大小，因此由表4可知，7種微量成分對核桃油OSI的影響程度依次為:生育酚＞總酚＞黃酮＞共軛烯烴＞羰基化合物＞β-胡蘿卜素＞磷脂。在具有抗氧化作用的微量組分中，生育酚對核桃油氧化穩定性的影響最大，為53.62%;其次為總酚，20.18%、黃酮，17.78%。而具有促氧化作用的共軛烯烴和羰基化合物對核桃油OSI的影響程度分別為5.25%和2.38%。

2.2.3 微量組分與核桃油初級、次級氧化相關性

共軛烯烴是油脂氧化過程中的初級產物指標，而羰基化合物是油脂氧化的主要次級產物，因此可以用共軛烯烴值和羰基價分別表示油脂初、次級氧化程度。由2.2.1結果可知，胡蘿卜素、磷脂、總酚、黃酮及生育酚5種微量組分均具有一定的抗氧化能力，因而進一步利用回歸分析研究5種抗氧化微量組分與核桃油初、次級氧化相關程度，結果如表5所示。

表5 抗氧化微量組分與核桃油初、次級氧化相關性Table 5 Relative contribution of each micro component contents to primary and secondary oxidation of walnut oil

由表5可看出，5種抗氧化微量組分對初級氧化和次級氧化的抑制程度不盡相同。其中，對核桃油OSI影響較大的3種微量組分——生育酚、總酚、黃酮對初級氧化的抑制作用分別為40.22%、1.94%、19.14%，而對次級氧化的抑制作用分別為21.67%、43.07%、14.90%，可見生育酚抑制核桃油初級氧化的作用大于次級氧化，總酚抑制核桃油次級氧化的作用大于初級氧化，而黃酮對核桃油初級氧化和次級氧化的抑制作用相差不大。β-胡蘿卜素對核桃油初級氧化的抑制作用(37.92%)是對次級氧化的抑制作用(8.53%)的5倍左右;相反，磷脂對核桃油次級氧化的抑制作用(11.82%)是對初級氧化抑制作用(0.79%)的10倍以上?？梢?，5種微量組分對初級氧化的抑制作用生育酚＞β-胡蘿卜素＞黃酮＞總酚＞磷脂;對次級氧化的抑制作用總酚＞生育酚＞黃酮＞磷脂＞β-胡蘿卜素。

3 結論

通過以上研究發現，核桃油具有一定的體外抗氧化活性，能有效清除DPPH·和ABTS+·，且核桃油的體外抗氧化活性與其氧化穩定性(OSI)顯著相關。此外，核桃油中的微量組分對核桃油氧化穩定性影響顯著，其中共軛烯烴和羰基化合物具有促氧化作用，而多酚、生育酚、黃酮、β-胡蘿卜素、磷脂具有抗氧化作用。同時發現，核桃油中不同抗氧化微量組分對其氧化穩定性影響能力不同，且同一微量組分對核桃油初級和次級氧化過程的抑制作用也存在差異，說明在油脂的氧化進程中，不同的抗氧化物質可能作用機理不同。因此，為了提高核桃油的氧化穩定性，改善其營養品質及延長貨架期，在油脂加工過程中應盡量保留其抗氧化微量物質，或以此為基礎開發適合的天然抗氧化劑，進一步提高核桃油的營養價值及貨架壽命。

［1］ 曹君，李紅艷，鄧澤元.植物油氧化穩定性的研究進展［J］.食品工業科技，2013，34(7):378-386.

［2］ Miraliakbari H，Shahidi F.Antioxidant activity of minor components of tree nut oils［J］.Food Chemistry，2008，111(2):421-427.

［3］ Reza F，Razieh N，Mitra R，et al.Kinetic parameter determination of vegetable oil oxidation under rancimat test conditions［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2008，110(6):587-592.

［4］ Jierong Y，Mogens L A，Leif H S.Interactions between tocopherols，tocotrienols and carotenoids during autoxidation of mixed palm olein and fish oil［J］.Food Chemistry，2011，127(4):1 792-1 797.

［5］ Antonella D L，Vincenzo M.Heat-oxidation stability of palm oil blended with extra virgin olive oil［J］.Food Chemistry，2012，135(3):1 769-1 776.

［6］ Mohamed F R，Joerg-Thomas M，Screening of the antiradical action of vegetable oils［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2006，19(8):838-842.

［7］ Jiyeun L，Eunok C.Effects of phospholipids on the antioxidant activity of α-tocopherol in the siglet oxygen oxidation of canola oil［J］.New Biotechnology，2011，28(6):691-697.

［8］ Jana V，Martina D，Miroslay O，et al.Lipophilic rutin derivatives for antioxidant protection of oil-based foods［J］.Food Chemistry，2010，123(1):45-50.

［9］ Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolourisation assay ［J］.Free Redical Biology and Medicine，1999，26(1):1 231-1 237.

［10］ 黃海蘭，趙祖亮，王斌貴.磷鉬絡合物法與β-胡蘿卜素-亞油酸法測定海藻脂類成分抗氧化活性的比較［J］.中國油脂，2005，30(3):32-35.

［11］ Luis C M，José A P，Paula B A，et al.Evaluation of a numerical method to predict the polyphenols content in monovarietal olive oils［J］.Food Chemistry，2007，3(102):976-983.