菊芋粕菊粉的酶法提取、組成及抗氧化活性研究

王曉喜，李 雁，李國強，陳 琦，喬亞俊，杜玉枝，李天才*，畢宏濤*

1中國科學院西北高原生物研究所 青海省藏藥藥理學與安全性評價研究重點實驗室，西寧 810000；2中國科學院大學，北京 100049

菊芋(HelianthustuberosusL.)系菊科向日葵屬植物，菊粉是其主要的干物質組成成分，含量占比超過干物質重量的60%[1]。菊芋是我國菊粉工業化生產的主要原料，目前其工業化提取技術以連續熱水浸提法為主[2]。菊芋菊粉生產過程產生大量的廢棄物——菊芋粕，其濕重約占原料重量的65%，大多作為飼料直接出售[3]。由于菊芋粕中含有大量的糖類物質[4]，主要包括果膠和未提取完全的菊粉[5]，所以為了充分利用菊芋資源，提高菊芋產品的附加值，菊芋粕的再次利用越來越受到業界的關注。目前，菊芋粕再利用研究主要集中于果膠、果糖和蛋白質等成分的提取技術[6]。由于菊芋粕中含有大量的果膠，而難溶性原果膠所形成的細胞骨架，嚴重妨礙了菊芋粕中菊粉的提取，所以尚缺少菊芋粕菊粉的高效提取技術，造成菊芋菊粉的整體產率無法有效提升。本研究針對菊芋粕菊粉提取效率低的難題，采用果膠酶輔助提取方法對菊芋粕菊粉的高效提取技術進行研究，并對菊芋粕菊粉的抗氧化能力進行評價，以期為菊芋粕的再利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮菊芋塊莖，甘肅白銀熙瑞生物工程有限公司提供；果膠標準品，購自北京索來寶科技有限公司；D-半乳糖醛酸，水溶性維生素E(Trolox)、二苯基苦基苯肼(DPPH)，購自美國Sigma-Aldrich公司；蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標準品，購自西寶生物科技(上海)股份有限公司；果膠酶(CAS號:9032-75-1)，自南寧東恒華道生物科技有限公司；2,2-聯氨基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS二胺鹽)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)，購自上海源葉生物科技有限公司；菲啰嗪，購自上海玉博生物科技有限公司；二乙氨乙基纖維素(DEAE纖維素)，上海恒信化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

SJZX多功能酶標儀，珀金埃爾儀器有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機，EYELA東京理化器械株式會社；Mettler Toledo AL104分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Sigma 3-18KS離心機，德國Sigma公司；Milli-Q Academic A10超純水系統，美國Millipore公司；IS50傅里葉變換紅外近紅外-拉曼光譜連用儀，美國thermo公司；LC-10CT液相色譜儀，島津日本公司。

1.3 菊粉的提取及含量測定

新鮮菊芋塊莖切成薄片，按照1∶5(w/w)料液比，沸水中提取1 h，紗布過濾后，分別收集濾液和菊芋粕。濾液濃縮后冷凍干燥，得到初提粗菊粉樣品，-20 ℃保存備用。新鮮菊芋粕冷凍干燥后，粉碎、過篩，按照料液比1∶20(w/w)，加入含有果膠酶的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在一定溫度范圍加熱提取。提取液離心后，收集上清液，測定總糖含量和還原糖含量，計算非還原糖得率。

果膠酶酶活按照Zhang等[7]方法進行測定，以果膠酶每分鐘分解果膠產生1 μmol半乳糖醛酸定義為1個酶活?？偺呛康臏y定以果糖為標準品采用苯酚-硫酸法，還原糖含量的測定以葡萄糖為標準品采用二硝基水楊酸(DNS)法，菊粉得率計算公式如下：

非還原糖得率(%)=(總糖含量-還原糖含

量)/菊芋粕重量×100%

1.4 菊芋粕中菊粉的酶法提取工藝優化

以酶加量(U/g)、提取pH、提取溫度、提取時間4個因素作為指標，先后進行單因素試驗，確定各因素的適宜提取范圍，然后以各因素的適宜提取范圍作為響應曲面設計試驗的不同水平進行響應曲面設計，從而確定最佳提取條件。

1.4.1 pH值對菊粉得率的影響

固定提取條件為提取溫度50 ℃、酶底比6.5 U/g、提取時間1.5 h，考察不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)對菊粉得率的影響。

1.4.2 提取溫度對菊粉得率的影響

固定提取條件為pH4.5、酶底比6.5 U/g、提取時間1.5 h，考察不同提取溫度(40、45、50、55、60 ℃)對菊粉得率的影響。

1.4.3 酶底比對菊粉得率的影響

固定提取條件為pH4.5、溫度50 ℃、提取時間1.5 h，考察不同酶底比條件(0.315、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、40 U/g)對菊粉得率的影響。

1.4.4 提取時間對菊粉得率的影響

固定條件為pH4.5、溫度50 ℃、酶底比10 U/g，考察不同提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對菊粉提取率的影響。

1.4.5 菊芋粕中菊粉的酶法提取工藝的響應曲面設計實驗

在單因素實驗基礎上，進行4因素3水平的響應曲面設計(Box-Benhnken中心組合法)實驗，以菊粉得率為響應值，各因素的3個水平采用-1、0、1進行編碼(見表1)。

表1 響應面設計試驗因素水平和編碼

1.5 菊芋菊粉的純化及含量測定

菊芋粕酶法提取的粗菊粉提取液，沸水浴滅活果膠酶后離心去除沉淀，上清液經蒸餾水透析(截留分子量500 Da)除鹽后冷凍干燥，得到菊芋粕酶法提取粗菊粉。隨后，初提粗菊粉和菊芋粕酶法提取粗菊粉，分別采用DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱(55 cm×10.5 cm i.d.)進行純化，收集蒸餾水洗脫部分，凝縮后冷凍干燥，得到純化菊粉樣品，分別命名為初次水提菊粉(primary water-extracted inulin，PWI)和二次酶提菊粉(secondary enzymatic-extracted inulin，SEI)。

純化后菊粉樣品的蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定(牛血清白蛋白為標準品)，糖醛酸含量采用間羥基聯苯法測定(半乳糖醛酸為標準品)，菊粉含量測定方法同1.3所述。

1.6 菊粉聚合度的測定

菊粉樣品的聚合度采用疏水相互作用液相色譜法(HILIC)[8]進行測定，應用分析型麥芽糖基鍵合色譜柱(analytical ‘click’ maltose column，5 μm，100 ?，100× 4.6 mmid，浙江華譜新創科技有限公司)，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為標準品，流動相為65%乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.7 體外抗氧化活性的測定

總抗氧化能力采用ABTS法測定，樣品總抗氧化能力以Trolox當量(TEAC，即每克樣品相當于x毫克Trolox，mgTE/g)及ABTS自由基清除率表示[9]；有機自由基DPPH清除能力，按照Arise等(2016)方法[10]測定；羥基自由基(·OH)清除能力，按照Halliwell等[11]的方法測定；超氧負離子清除能力，采用NADH-NBT-PMS體系[12]測定；還原力采用FRAP方法[13]測定；二價鐵離子螯合能力，采用Dinis等[14]的方法測定，EDTA作為陽性對照物。

1.8 數據處理

每項實驗均重復6次，取平均值，數據以平均值±標準差的形式表述。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化實驗的作圖及分析。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖及分析數據，one-way ANOVA進行顯著性檢驗，P<0.05為顯著性差異。

2 結果分析

2.1 pH值對菊粉得率的影響

從圖1A可以看出，pH值對菊粉得率影響顯著，菊粉得率隨著pH值升高呈先增加后降低的趨勢，在pH4.5時，菊粉得率達到最大值33.16%。這可能是由于在pH4.5時果膠酶的酶活最高，其造成的細胞壁中果膠類多糖的破壞促進了菊粉成分溶出。

2.2 溫度對菊粉得率的影響

如圖1B所示，在40～60 ℃范圍，菊粉得率隨著溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，在50 ℃時得率最高，菊粉得率為31.76%?？梢?，該溫度下果膠酶酶活作用與菊粉溶解性共同促進了菊芋粕菊粉的溶出。

2.3 酶底比對菊粉得率的影響

如圖1C所示，菊粉得率隨著酶底比的增加呈現先增加后下降的趨勢。在酶底比0.315～2.5 U/g時，菊粉得率隨酶底比增加而顯著上升；2.5～20 U/g范圍內，菊粉得率變化較小，10 U/g時菊粉得率最高，達到35.08%；酶底比大于20 U/g時，菊粉得率隨酶底比增加而顯著下降。上述結果可能由于酶底比較低時，果膠酶未能充分破壞細胞壁，而在較高酶底比時，提取液粘度增大造成菊粉不易溶出。

2.4 提取時間對菊粉得率的影響

如圖1D所示，當提取時間不足1.5 h時，延長提取時間可以顯著增加菊粉得率。提取1.5 h時，菊粉得率為33.1%，繼續延長提取時間對菊粉得率的影響較小。

圖1 pH值(A)、提取溫度(B)、酶底比(C)、提取時間(D)對菊芋粕菊粉得率的影響Fig.1 Effects of pH,extraction temperature,enzyme-substrate ratio and extraction duration on the yield 注：圖中小寫字母表示單因素實驗中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor experiment.

2.5 響應曲面設計實驗結果

在單因素實驗基礎上，根據Box-Benhnken中心組合法實驗設計原理，以菊粉提取率為響應值，以pH值(A)、溫度(B)、酶底比(C)、提取時間(D)為自變量，建立四因素三水平中心組合實驗設計，共包括29個實驗方案，24個分析試驗點，5個中心試驗點，用來計算試驗誤差。菊芋粕菊粉提取的響應面實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果

續表2(Continued Tab.2)

實驗號No.A:pH值pH valueB:溫度Extraction temperature(℃)C:酶底比Enzyme-substrate ratio(U/g)D:提取時間Extraction time (h)Y:菊粉得率Yield of inulin (%)17-101032.96±0.42181-10031.37±1.1419000035.38±0.482000-1136.91±0.8721010133.06±0.3222000036.75±0.652300-1-134.36±0.542401-1033.46±1.3325011031.52±0.6126000035.24±0.54270-11032.75±0.78280-1-1033.55±1.112910-1033.35±0.33

2.5.1 回歸模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6對所得數據進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程如下：

Y=35.66-0.077A-0.52B-0.91C+0.59D

+0.79BC+0.79AD-0.76BD-2.05A2

-1.76B2-1.01C2

2.5.2 回歸模型的方差分析

為了確定響應面實驗設計中4個因素對菊粉提取效果的影響，以及各個因素的交互作用和顯著性，進行回歸方差分析(表3)。結果表明，失擬項不顯著(P>0.05)，而模型極顯著(P<0.000 1)，其中R2=0.901 1，說明預測值和實際值具有高度的相關性。通過模擬系數顯著性性檢驗，得到提取因素的主效應關系：A>D>C>B，即酶底比>pH值>提取溫度>提取時間，因素BD、AB、AD和C2對提取效果顯著，而因素A、B、C、A2、B2、C2對提取效果具有極顯著的影響。

表3 方差分析結果

續表3(Continued Tab.3)

方差來源Source平方和Quadratic sum自由度Df均方Mean square F值F-valueP值P-value顯著性SignificanceB221.747 13121.747 1352.759 38< 0.000 1**C27.559 30117.559 30118.339 160.000 8**D20.819 91810.819 9181.989 1510.180 3殘差5.770 725140.412 195失擬4.229 425100.422 9431.097 6260.506 1Not significant誤差1.541 29940.385 325總和84.136 8928

注：**P<0.01為極顯著；*P<0.05為顯著。

Note:**P<0.01was considered to be extremely significant;*P<0.05 was considered to be significant.

2.5.3 響應面分析

根據軟件Design-Expert獲得響應值的3D曲面，分析各因素對菊粉得率的影響及各因素之間的交互作用。圖2～7中所示為pH、提取溫度、酶底比、提取時間中任意兩個因素為零水平時，其余兩個因素間的交互作用對菊粉得率的影響。菊粉的得率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢，達到某一定值時，曲面稍下降或趨于平緩。圖2、4和6曲面陡峭，說明pH和溫度、pH和時間、溫度和時間之間交互作用明顯，與方差分析結果一致。

圖2 pH值和提取溫度對菊粉得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plot for pH value and extraction temperature effect on the yield of inulin

圖3 pH值和酶底比對菊粉得率影響的響應面圖Fig.3 Response surface plot for pH value and enzyme-substrate ratio effect on the yield of inulin

圖4 pH值和提取時間對菊粉得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plot for pH value and extraction time effect on the yield of inulin

圖5 提取溫度和酶底比對菊粉得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot for extraction temperature and enzyme-substrate ratio effect on the yield of inulin

2.5.4 參數優化及最優條件的驗證

在選取的因素范圍內，根據上述回歸模型分析得出，SEI的最佳酶法提取條件為：pH值4.51、提取溫度48.46 ℃、酶底比7.59 U/g、提取時間2 h。根據最佳條件和實際提取條件可操控性，調整提取條件為：pH4.5、提取溫度50 ℃、酶底比7.5 U/g、提取時間2 h。經3次重復實驗，測得的SEI得率為35.30%±0.85%，與預測值36.6%無顯著差別，說明上述模型與實際情況擬合較好。與傳統熱水浸提法相比(提取條件：料液比1∶20 w/w、提取時間2 h，提取溫度80 ℃，菊粉得率：25.26%±0.50%)，SEI得率提高38.16%。

圖6 提取溫度和提取時間對菊粉得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot for extraction temperature and extraction time effect on the yield of inulin

2.6 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)組成成分比較

由于提取順序和提取方式的不同可能會對菊粉的組成產生影響，我們對PWI和SEI的組成成分進行了測定。結果如表4、表5所示，SEI的總糖和菊粉含量均顯著高于PWI(P<0.05)。在菊粉聚合度方面，PWI中蔗果三糖和蔗果四糖含量較高，而SEI中蔗果五糖、蔗果六糖及其以上聚合度菊粉的含量較高。該結果可能是由于低聚合度菊粉溶解度較大而最先被提取，而聚合度較高的菊粉溶解度較小或受限于果膠等細胞壁成分束縛而較難被提取。當采用果膠酶輔助提取時，細胞壁成分被破壞，聚合度較高的菊粉被提取出來。

圖7 酶底比和提取時間對菊粉得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot for enzyme-substrate ratio and extraction time effect on the yield of inulin

表4 純化菊粉組分的總糖、菊粉、半乳糖醛酸和蛋白質含量

注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

表5 純化菊粉組分的聚合度組成分析結果

注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7 抗氧化活性測定結果

2.7.1 總抗氧化能力

采用總抗氧化能力法測定ABTS自由基清除能力，Trolox為標準品，標準曲線繪制以Trolox含量X(ng/μL)為橫坐標，ABTS自由基清除率Y(%)為縱坐標，回歸方程為Y=0.007 5X(R2=0.997 1)。結果如圖8所示，PWI和SEI的ABTS自由基清除能力均隨著樣品濃度增加而上升。當樣品濃度為5 mg/mL時，SEI的ABTS自由基清除能力顯著優于PWI(P<0.05)，二者TEAC值分別為3.93±1.02和2.95±0.47 mg TE/g。

2.7.2 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，兩種菊粉樣品的DPPH清除能力均隨著劑量濃度的增加而呈上升趨勢。在0～0.4 mg/mL濃度范圍內，SEI的DPPH清除能力優于PWI，但是在0.4～0.6 mg/mL濃度范圍時二者差異發生反轉，0.6～1.0 mg/mL時PWI的DPPH清除能力顯著優于SEI。1.0 mg/mL濃度時，PWI和SEI的DPPH清除率分別為15.1%±0.139%和10.6%±0.76%。

圖8 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

圖9 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的DPPH自由基清除率測定結果Fig.9 DPPH-scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7.3 羥基自由基(·OH)清除能力

如圖10所示，兩種菊粉樣品的·OH清除率均隨著濃度的增加而上升。在1～5 mg/mL濃度范圍內，PWI的·OH清除率為1.58%～18.01%，SEI的·OH清除率為1.15%～19.32%。在1和4 mg/mL濃度時，PWI清除能力顯著高于SEI(P<0.05)；5 mg/mL時，SEI清除能力顯著高于PWI(P<0.05)。

2.7.4 超氧負離子清除能力

如圖11所示，兩種菊粉樣品的超氧負離子清除能力均隨著劑量濃度的增加而增強，但是SEI比PWI的超氧負離子清除能力增強幅度更加顯著。在1 mg/mL濃度時，PWI的超氧負離子清除能力顯著優于SEI，而3～5 mg/mL濃度時，SEI的超氧負離子清除能力顯著優于PWI。5 mg/mL濃度時，PEI和SEI的超氧負離子清除率分別為16.47%±0.25%和20.15%±0.68%(P<0.05)。

圖10 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的·OH清除能力Fig.10 Hydroxyl radical-scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

圖11 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的超氧負離子清除能力Fig.11 Superoxide anion scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7.5 Fe2+螯合能力

如圖12所示，SEI的Fe2+螯合能力呈濃度劑量依賴關系，隨著濃度的增加而上升。在5 mg/mL時，其Fe2+螯合率達到15.02±0.50%。然而，PWI未表現出Fe2+螯合能力。

2.7.6 還原力

如圖13所示，兩種菊粉樣品的還原力隨濃度增加而增強。在樣品濃度為5 mg/mL時，二者的還原力達到了最大值，其中PWI的還原力顯著優于SEI，700 nm時二者的吸光度分別為0.129±0.006和0.083±0.006(P<0.05)。

圖12 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的Fe2+螯合能力Fig.12 Fe2+chelation abilities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI)

圖13 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的還原力Fig.13 Reducing power of primary water-extracted inulin and secondary enzymatic-extracted inulin.注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

3 結論

菊粉是由D-果糖經β-l,2糖苷鍵連接而成的線性直鏈狀多糖，末端常含一個葡萄糖殘基。歐洲的菊粉工業化生產以菊苣為原料，在我國則以菊芋為原料。我國開展菊芋菊粉研究的起步較晚，且無法應用歐洲的菊苣工業化生產技術，因此導致了菊芋菊粉生產工藝相對落后。目前，我國菊芋菊粉的工業生產大多采用甜菜制糖的提取設備和生產工藝。魏凌云等采用響應面法對菊芋菊粉的熱水浸提工藝進行了優化，在自然pH值、溫度為76.7 ℃、液固比為 10.56∶1(v/w)、提取時間20 min的最佳工藝條件下，菊粉提取率達到83.6%[15]。胡建鋒等采用超聲波輔助提取技術對菊粉熱水提取工藝進行改進，菊粉得率達到 63.37%[16]。上述熱水浸提生產菊芋菊粉的過程中，產生了大量的工業廢棄物-菊芋粕。菊芋粕中仍含有果膠、菊粉、纖維素/半纖維素等大量糖類化合物，其中菊粉含量最多可達到6%。因此，從菊芋粕中深層提取菊粉，有望在不改變原有菊粉生產工藝的條件下，以較低成本解決國內企業菊芋菊粉提取效率低的產業化瓶頸問題。目前，研究人員已經開始關注菊芋粕的高效利用，已有關于菊芋粕中果膠和單糖的二次利用研究的報道[1,8]，但是還沒有關于菊芋粕中菊粉提取技術的報道。

本研究以菊芋粕為研究材料，采用酶法提取技術對其中殘留菊粉進行深層提取，提高殘余菊粉的提取效率，并對PWI和SEI的組成和抗氧化活性進行比較研究，初步探討提取方式和順序對菊粉組成和活性的影響。結果表明，采用響應面法優化的果膠酶輔助提取菊粉的最佳工藝(pH值4.5、提取溫度50 ℃、酶底比7.5 U/g、提取時間2 h)，菊芋粕菊粉的得率比傳統熱水浸提法提高38.16%。已有研究發現，提取方法能夠影響多糖的抗氧化活性，特別是酶法提取多糖較傳統熱水水提多糖具有更強的抗氧化能力[19,20]。同樣，本研究結果表明，SEI的抗氧化活性優于PWI。體外抗氧化活性評價方法涉及到自由基鏈反應的引發、傳遞與終止每個環節，并且測得不同體外抗氧化活性評價方法之間的抗氧化活性基本趨勢一致。二者產生抗氧化能力差異的原因推測可能有2個方面：(1)SEI羥基等活性基團暴露量較多，易與自由基充分作用，進而能將更多的自由基轉變成穩定的物質，終止自由基的鏈反應；(2)SEI中高聚合度菊粉含量較高，粘度較大，易于結合那些能與H2O2反應的金屬離子，形成螯合物，從而遏抑羥基自由基的產生[21]。綜上所述，本研究發現果膠酶酶法提取技術能夠顯著增加菊芋粕菊粉的得率，且酶法提取菊芋粕菊粉(SEI)與熱水初次提取菊芋菊粉(PWI)相比抗氧化能力更強。因此，果膠酶輔助提取方法有望為菊芋粕菊粉的高效利用問題提供新的解決思路。