兩段式腌制過程中三穗咸蛋黃揮發性風味物質的變化研究

包歡歡,王修俊,*,于沛,何春霞,李佳敏,許九紅, 馮廷萃,吳擁軍

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025) 3(貴州大學 辣椒產業技術研究院,貴州 貴陽,550025)4(鎮遠縣名城食品廠,貴州 鎮遠,557700)

三穗鴨蛋具有營養豐富的特點,其制成咸鴨蛋后具有松沙出油和口感鮮香的特點[1-2]。蛋黃是三穗咸鴨蛋的品質體現與價值所在,因此常被應用于月餅和粽子等食品的餡料中[3-4]。目前,三穗咸鴨蛋的腌制方式主要有鹽水浸泡法和鹽泥涂抹法[5-6],但這2種方式的產品都存在蛋清鹽含量高的問題,從而導致口感過咸。為解決這個問題,本研究團隊利用兩段式鹽水浸泡法,將蛋清鹽含量控制在3.65%左右,且蛋黃出油量保持在68.82%左右,在保證咸蛋品質良好的同時改善了口感[7]。

三穗鴨蛋黃和市售鴨蛋相似,其腥味較雞蛋更重,不適于鮮食。鹽水的腌制,能在一定程度上降低三穗鴨蛋黃的腥味,同時給予其特殊的香味[8]。腌制過程中,NaCl的滲透會引起蛋黃內脂肪酸等物質發生化學反應,進而使咸蛋黃的風味發生變化,同時蛋黃的色澤、口感和質構等理化指標也會發生變化[9-12]。有研究報道腌制過程中蛋黃理化性質的變化和品質的變化之間具有較強的相關性,AI等[13]研究指出咸蛋在腌制過程中,NaCl會引起蛋黃蛋白質分子間作用力的變化,導致蛋白質三、四級結構發生改變而形成凝膠。DOU等[14]研究發現在NaCl的滲透作用下,蛋黃內部分脂質游離出來,在O2的參與下脂肪酸的組成發生改變,從而形成蛋黃“出油”的特性。然而,咸鴨蛋腌制過程中蛋黃的揮發性成分的變化規律尚未清晰。此外,三穗鴨蛋與其他鴨蛋在營養成分和揮發性物質組成上均存在差異,導致腌制中蛋黃揮發性風味物質的變化規律更為復雜,但目前關于三穗咸鴨蛋的風味物質變化等方面的理論研究鮮有報道。因此以三穗鴨蛋黃為對象,研究兩段式腌制過程中蛋黃揮發性風味物質的變化規律十分必要。

本研究以本課題組研制的兩段式腌制為基礎,采用GC-MS對腌制過程中蛋黃的揮發性成分進行定性和定量分析,探究咸蛋黃腌制過程中揮發性風味物質的變化規律。利用正交偏最小二乘法預測不同腌制階段的咸蛋黃在揮發性物質組成上的差異,并對咸蛋黃風味差異有主要貢獻作用的物質進行篩選,旨在探究兩段式腌制工藝下,三穗咸鴨蛋蛋黃的揮發性風味變化,從而為三穗咸鴨蛋的兩段式腌制技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三穗麻鴨蛋、食鹽、紅星二鍋頭,購買于貴陽市花溪區合力超市。

1.2 儀器與設備

FA2002B型分析天平,上海越平科學儀器有限公司;GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型電熱鼓風干燥箱,上海賀德試驗設備有限公司;50/30umCAR/PDMS/DVB型手動固相微萃取裝置,美國Supelco公司;SCIONSQ-456-GC型氣相色譜質譜聯用儀,美國布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 咸蛋黃的制備

咸蛋腌制液配制:第一階段腌制液為25%的食鹽溶液;第二階段腌制液為食鹽10%、香辛料0.6%、白酒0.7%(均為質量分數),工藝流程如下:

三穗麻鴨蛋→洗凈晾干→第一階段腌制8 d→取出晾干→第二階段腌制20 d

1.3.2 樣品預處理和揮發性風味成分測定

取搗碎均勻的5.0 g咸蛋黃樣品置于20 mL頂空瓶中,將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于60 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口,于250 ℃熱解析3 min,同時啟動儀器采集數據。

GC條件:色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱;載氣為高純He(99.999%);恒流,載氣流速1.0 mL/min;升溫程序,初始40 ℃,保持3 min,10 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min;汽化室溫度250 ℃。

MS條件:離子源為EI源;發射電流1.0 mA;電子能量70 eV;界面溫度250 ℃;離子源溫度200 ℃;檢測電壓2 000 V。

1.3.3 咸蛋黃揮發性成分的定量與定性

對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對NIST14和Wiley275標準質譜圖,結合保留指數(retention index, RI值)為定性依據,確定揮發性化學成分的種類;用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

1.3.4 正交偏最小二乘法判別分析

將不同腌制階段的蛋黃揮發性物質的相對含量進行正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA),利用解釋變量(R2Y)和預測能力(Q2Y)驗證模型的有效性,同時驗證模型是否存在過擬合現象。

1.3.5 潛在差異物質的篩選和鑒定

根據OPLS-DA模型中的投影變量重要性因子(variable importance in projection,VIP),即VIP值篩選潛在的差異特征物質。

1.4 數據分析

運用Excel 2019整理數據,Origin 2018、SIMCA 14.1 和TBtools軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 腌制過程中咸鴨蛋蛋黃揮發性風味成分組成

圖1為腌制過程中鴨蛋黃的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC),表1和圖2為蛋黃中具體的揮發性風味物質及其相對含量的變化圖。由圖1可知,鮮蛋黃中檢出31種揮發性風味物質,腌制7和14 d的蛋黃檢出36種,腌制21 d的蛋黃檢出37種,腌制28 d的蛋黃檢出42種,說明隨著NaCl的滲入,蛋黃的風味發生了顯著的變化。

圖1 腌制過程中蛋黃的總離子流圖Fig.1 TIC for fresh duck egg yolk

由表1可知,腌制過程中蛋黃醛類物質的種類最為豐富,共有14種,其中3-苯基-2-丙烯醛、(E)-2-庚烯醛和對甲氧基苯醛3種物質在鮮蛋黃中未檢出,而鮮蛋黃中(Z)-2-庚烯醛在鹽水腌制的作用下消失。由圖2可知,在腌制前14 d醛類物質含量升高速率較快,可能原因之一是NaCl的滲透促進了蛋黃中不飽和脂肪酸的氧化分解作用和氨基酸的Strecker降解,從而生成較多的醛類物質[15-16]。另一方面,腌制液中所添加的香辛料也對醛類等揮發性風味物質產生影響。

烷烯烴類物質主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂,烷烴類物質感覺閾值較高,一般認為對食品的整體風味貢獻較小[17-18]。表1展示了腌制過程中共檢測出的9種烷烯烴類物質,由表1可知,鮮蛋黃中烷烯烴類物質相對含量最高(39.949%),隨著腌制時間的延長,其相對含量呈現下降的趨勢,最終降低至23.159%。腌制過程中烷烯烴類物質相對含量的降低是食鹽的滲透作用導致的,這與吳涵等[19]關于腌制對魚肉風味物質的影響的研究結果相似。另外,茴香烯在鮮蛋黃中未檢出,而在腌制的蛋黃中出現,并且其相對含量隨腌制時間的延長呈升高的趨勢,因茴香烯主要存在于香辛料中[20],故判斷咸蛋黃中茴香烯相對含量的升高來源于腌制中所添加的香辛料。

醇類物質一般是由脂肪氧化分解或羰基化合物還原而生成的,其風味閾值較高,對食品的風味影響較小[21-22]。從表中可以看出,腌制7 d后,蛋黃中醇類化合物相對含量由10.642%增加至16.91%,之后的7 d其相對含量又降低至9.509%,并在腌制后半段(14～28 d)未有明顯變化,相對含量維持在10%左右。分析其原因,可能是由于腌制第一階段中腌制液的鹽濃度較高,高滲透壓促進了體系內脂肪氧化分解和羰基化合物還原,從而使醇類物質迅速提高。而腌制第二階段中體系內滲透壓發生變化,抑制了醇類物質的生成而促進了其他反應的發生,已生成的醇類化合物又被轉化為其他揮發性物質[23-24]。

酮類物質是脂肪氧化的另一主要產物,酮類物質具有特別的清香和花香風味,且呈味較持久[25]。由表1和圖2可知,酮類物質相對含量較低,在腌制前7 d呈現上升的趨勢,而在腌制14～28 d呈現下降的趨勢。另外僅在腌制21 d與28 d后的咸鴨蛋黃中檢測出2-壬酮,相對含量分別為0.366%和0.269%。

由表1可知,蛋黃中酯類和醚類化合物種類較少。在整個腌制過程中僅檢測出3-丁烯基異硫氰酸酯和丙酸丁酯2種酯類化合物。隨著腌制液的滲入,蛋黃中3-丁烯基異硫氰酸酯的相對含量由3.425%降低至0.269%,而丙酸丁酯在鹽水腌制的作用下消失。蛋黃中醚類化合物也會受到NaCl的影響,其中二甲基三硫醚隨腌制時間延長呈先升高后降低的趨勢,而二丁醚只在腌制后期(21～28 d)被檢測出,其相對含量在0.185%～0.249%范圍之間。1,3-二氯苯和乙苯等芳香族化合物也參與了咸鴨蛋黃風味的形成,在腌制過程中,蛋黃芳香族揮發性物質含量呈先升高后降低的趨勢,這與醇類物質的測定結果相類似。余平蓮[26]研究指出咸蛋黃中1,3-二氯苯等物質的生成來自膽固醇的氧化,較高濃度的NaCl能夠抑制這一氧化反應,因此芳香族類化合物的相對含量在腌制后期逐漸下降。

a-相對含量;b-種類數圖2 咸蛋黃腌制過程中風味物質相對含量變化Fig.2 Change of flavor substance categories in salted egg yolk curing process

2.2 基于正交偏最小二乘法的咸蛋黃風味差異分析

OPLS-DA是一種有監督的邏輯回歸模型,該模型能夠較為準確地體現各個樣品之間的差異,并按照差異物質的相關性將樣品進行分類。投影變量重要性因子是OPLS-DA中的重要參數之一,它可量化OPLS-DA中每個變量對樣本分類的貢獻度,從而有助于篩選潛在的差異特征物質。VIP值>1說明該物質對咸蛋黃的風味差異有主要的貢獻作用,VIP值越大說明該物質在樣品間的差異越顯著[27-29]。

本試驗將所測咸蛋黃揮發性成分的相對含量進行正交偏最小二乘法判別分析,旨在對不同腌制階段的咸蛋黃揮發性風味物質組成進行差異性分析。該模型中,解釋變量(R2Y)和預測能力(Q2Y)分別為0.99和0.96,說明該模型對咸蛋黃的差異性風味物質的預測和篩選是有效的,下面將對OPLS-DA結果進行分析和討論。

2.2.1 不同腌制階段蛋黃揮發性物質的差異性分析

由圖3可知,不同腌制時期的咸蛋黃在揮發性組分上存在組間差異,且組內樣本的一致性較好。在X軸上,未腌制的和鹽水腌制的咸蛋黃之間存在顯著的差異,說明鹽水的滲透能夠使咸蛋黃的揮發性成分發生較大的變化。在Y軸上,腌制7 d與14 d的咸蛋黃揮發性物質相對含量差異較小,而腌制14、21和28 d咸蛋黃的揮發性物質相對含量差異顯著,由此可將咸蛋黃的揮發性成分組成變化大致分為0～14 d、14～21 d和21～28 d 3個階段。

圖3 不同階段的蛋黃OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score of egg yolk at different stages

2.2.2 不同腌制階段蛋黃的潛在差異風味物質分析

如圖4所示,紅色標記的物質為篩選出的VIP值>1的物質,包括3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、對甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪、十三烷、(E)-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、5,6-十一碳二烯、間二甲苯、苯并吡咯、2-正戊基呋喃、對二甲苯、甲基肼、乙苯、苯甲醛、正己醇、二丁醚、正庚醇、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺?；淄?、丙酸丁酯、(Z)-2-庚烯醛、正十七烷等26種揮發性物質。其中3-辛烯-2-醇(VIP=1.205)、3-苯基-2-丙烯醛(VIP=1.202)、苯乙醇(VIP=1.163)、3-辛酮(VIP=1.144)、對甲氧基苯醛(VIP=1.136)、1,3-二氯苯(VIP=1.119)、2,5-二甲基吡嗪(VIP=1.084)等物質VIP值相對較大,推測可能是影響咸蛋黃香味差異的重要揮發性物質。

圖4 揮發性風味物質VIP值Fig.4 VIP value of volatile flavor substances

2.2.3 蛋黃差異風味物質的層次聚類分析

為了直觀地體現各腌制階段咸蛋黃揮發性風味物質特征的差異,將OPLS-DA篩選出的27種揮發性物質進行層次聚類分析,并利用熱圖進行展示。如圖5所示,顏色表示各物質相對含量的高低,藍色越深表示其相對含量越低,紅色越深表示其相對含量越高。從圖中可以看出,5個腌制階段的咸蛋黃可按照其揮發性物質組成的差異分為2類,第一類是未腌制的咸蛋黃(0 d),第二類是腌制7 d至28 d的咸蛋黃,這與2.2.1節中OPLS-DA分析的結果相類似。腌制結束后,5,6-十一碳二烯、正庚醇、3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪的相對含量較高。其中3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪香氣閾值較低,對咸蛋黃的風味影響較大,并賦予了咸蛋黃苦杏仁、青草、柑橘、油脂香、水果香和花香等多種風味[30-31]。其他閾值較大且相對含量在腌制中呈上升趨勢的揮發性物質作為香氣前體物質或助香物質,與主要的風味物質協調而形成咸蛋黃的風味特征。對二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺?；淄?、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等物質在鮮蛋黃中相對含量較高,而在腌制過程中相對含量較低,由此推測是蛋黃呈腥味的重要物質。

圖5 不同腌制階段咸蛋黃的差異風味物質聚類分析熱圖Fig.5 Heat map of cluster analysis of differential flavor substances of salted egg yolk at different curing stages

3 結論

GC-MS檢測結果表明在兩段式腌制過程中,三穗鴨蛋蛋黃的揮發性風味物質的含量會發生顯著變化。經過腌制,蛋黃的揮發性風味物質種類顯著增多,由鮮蛋黃的31種到腌制結束后的42種,其中對咸蛋黃風味影響較大的有醛、醇、酮、酯、芳香族、烷烯烴等6類揮發性物質。在腌制液中添加香辛料能夠使蛋黃內茴香烯等揮發性物質的含量顯著提高,并賦予咸蛋黃特殊的香味。OPLS-DA和聚類分析的結果說明NaCl能顯著改變鴨蛋黃的揮發性成分的組成,并且隨著蛋黃內鹽濃度的提高,各腌制時期的蛋黃揮發性組分的差異越顯著。蛋黃中3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、對甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪等物質的VIP值相對較大,是影響咸蛋黃特征風味差異的重要揮發性物質。此外,對二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺?；淄?、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等8種VIP值>1的物質,在未腌制的鴨蛋黃中相對含量較高,在腌制過程中相對含量較低,推測是貢獻蛋黃腥味的潛在物質。